Purificación de tubulina con modificaciones posttranslacionales controladas e isotipos de fuentes limitadas por ciclos de polimerización-despolimerización

Summary

Este protocolo describe la purificación de la tubulina a partir de fuentes pequeñas/medianas como células cultivadas o cerebros de ratón único, utilizando ciclos de polimerización y despolimerización. La tubulina purificada se enriquece en isotipos específicos o tiene modificaciones posttranslacionales específicas y se puede utilizar en ensayos de reconstitución in vitro para estudiar dinámicas e interacciones de microtúbulos.

Abstract

Un aspecto importante de los estudios del citoesqueleto de microtúbulos es la investigación del comportamiento de los microtúbulos en experimentos de reconstitución in vitro. Permiten el análisis de las propiedades intrínsecas de los microtúbulos, como la dinámica, y sus interacciones con proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs). El “código de tubulina” es un concepto emergente que apunta a diferentes isotipos de tubulina y varias modificaciones posttranslacionales (PTM) como reguladores de propiedades y funciones de microtúbulos. Para explorar los mecanismos moleculares del código de tubulina, es crucial realizar experimentos de reconstitución in vitro utilizando tubulina purificada con isotipos y PTM específicos.

Hasta la fecha, esto era técnicamente desafiante como la tubulina cerebral, que es ampliamente utilizada en experimentos in vitro, alberga muchos PTM y tiene una composición isotipo definida. Por lo tanto, desarrollamos este protocolo para purificar la tubulina de diferentes fuentes y con diferentes composiciones isotipos y PTMs controlados, utilizando el enfoque clásico de los ciclos de polimerización y despolimerización. En comparación con los métodos existentes basados en la purificación de la afinidad, este enfoque produce tubulina pura y competente para la polimerización, ya que la tubulina resistente a la polimerización o despolimerización se descarta durante los sucesivos pasos de purificación.

Describimos la purificación de la tubulina de las líneas celulares, cultivada ya sea en suspensión o como cultivos adherentes, y de cerebros de ratón únicos. El método describe primero la generación de masa celular tanto en la suspensión como en los ajustes adherentes, el paso de lisis, seguido de las sucesivas etapas de purificación de la tubulina mediante ciclos de polimerización-despolimerización. Nuestro método produce tubulina que se puede utilizar en experimentos que abordan el impacto del código de tubulina en las propiedades intrínsecas de microtúbulos e interacciones de microtúbulos con proteínas asociadas.

Introduction

Los microtúbulos desempeñan un papel crítico en muchos procesos celulares. Dan a las células su forma, construyen husillos meioticos y mitoticos para la segregación cromosómica, y sirven como pistas para el transporte intracelular. Para realizar estas diversas funciones, los microtúbulos se organizan de diferentes maneras. Una de las preguntas intrigantes en el campo es entender los mecanismos moleculares que permiten que los microtúbulos conservados estructural y evolutivamente se adapten a esta plétora de organizaciones y funciones. Un mecanismo potencial es la diversificación de los microtúbulos, que se define por el concepto conocido como el ‘código de tubulina’^1,2,3. El código de tubulina incluye dos componentes principales: la incorporación diferencial de productos genéticos de α y β-tubulina (isotipos de tubulina) en los microtúbulos y modificaciones posttransacionales de tubulina (PTM).

Desde la década de 1970, los experimentos de reconstitución in vitro, combinados con técnicas de microscopía ligera en evolución, han allanado el camino para importantes descubrimientos sobre las propiedades de los microtúbulos: inestabilidad dinámica⁴ y cinta de correr^5,y sus otros mecanismos y funciones^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.} Casi todos los experimentos in vitro realizados hasta ahora se han basado en la tubulina purificada del tejido cerebral utilizando ciclos repetidos de polimerización y despolimerización^16,17. Aunque la purificación del tejido cerebral confiere la ventaja de obtener tubulina de alta calidad en grandes cantidades (generalmente cantidades de gramo), un inconveniente importante es la heterogeneidad ya que la tubulina purificada del tejido cerebral es una mezcla de diferentes isotipos de tubulina y se enriquece con muchos PTMs de tubulina. Esta heterogeneidad hace imposible delinear el papel de un PTM de tubulina en particular o isotipo en el control de propiedades y funciones de microtúbulos. Por lo tanto, producir tubulina competente para el montaje con PTMs de tubulina controlados y composición homogénea del isotipo es esencial para abordar los mecanismos moleculares del código de tubulina.

Recientemente, se ha desarrollado un enfoque para purificar la tubulina mediante cromatografía de afinidad utilizando el dominio tog (gensobreexpresado tumoral) de levadura Stu2p. En este método, la tubulina en liatos crudos de células o tejidos se pasa a través de una columna donde se une al dominio TOG inmovilizado por matriz, lo que permite el análisis de toda la piscina de tubulina de una muestra dada, incluso muy pequeña. Un enfoque largamente esperado para purificar la tubulina recombinante también ha sido descrito en los últimos años. Se basa en el sistema baculovirus, en el que se expresa un vector bi-cistrónico que contiene genes α y β-tubulina en las células de insectos^19. Sin embargo, este método es muy engorroso y lento y por lo tanto se utiliza principalmente para estudiar el impacto de las mutaciones de tubulina²⁰ y isotipos de tubulina^21,22,23 in vitro.

En el protocolo actual, describimos un método que utiliza el enfoque de polimerización-despolimerización bien establecido y ampliamente utilizado como un plan para generar tubulina con diferentes niveles de modificación ya sea a partir de líneas celulares o del tejido cerebral del ratón^24. En este procedimiento, la tubulina se ciclo entre el soluble (trobulina dimer a 4 °C) y forma polimerizada (microtúbulos a 30 °C en presencia de guanosina 5′-tripfosfato [GTP]). Cada forma se separa a través de sucesivos pasos de centrifugación: los atenuadores de tubulina permanecerán en el sobrenadante después de un giro frío (4 °C), mientras que los microtúbulos se peletizarán a 30 °C. Además, se lleva a cabo un paso de polimerización a alta concentración de piperazina-N,N′-bis(ácido etanoesulfónico) (PIPES), que permite la eliminación de proteínas asociadas a microtúbulos de los microtúbulos y, por lo tanto, de la tubulina finalmente purificada. La tubulina purificada a partir de células HeLa S3 cultivadas como cultivos de suspensión o adherentes está virtualmente libre de cualquier PTM de tubulina y se ha utilizado en experimentos recientes de reconstitución in vitro^25,26,27,28. Hemos adaptado aún más el método para purificar la tubulina de cerebros de ratón único, que se pueden utilizar para un gran número de modelos de ratón con cambios en isotipos de tubulina y PTM.

En el protocolo, primero describimos la generación del material de origen (masa celular o tejido cerebral), su lisis(Figura 1A),seguido de los sucesivos pasos de polimerización y despolimerización de la tubulina para purificar la tubulina (Figura 1B). Además, describimos el proceso para evaluar la pureza(Figura 2A,B)y la cantidad (Figura 3A,B) de la tubulina purificada. El método se puede adaptar para producir tubulina enriquecida con un PTM seleccionado mediante la sobreexpresión de una enzima modificadora en las células antes de la purificación de la tubulina (Figura 4B). Alternativamente, las enzimas modificadores de la tubulina se pueden agregar a la tubulina durante el proceso de purificación. Por último, podemos purificar la tubulina carente de isotipos específicos o PTMs de los cerebros de ratones deficientes en las correspondientes enzimas modificadores de la tubulina (Figura 4B)²⁹.

El método que describimos aquí tiene dos ventajas principales: (i) permite la producción de cantidades suficientemente grandes de tubulina en un tiempo relativamente corto, y (ii) genera tubulina pura de alta calidad, con composición isotipo de tubulina específica o PTM. En el video asociado de este manuscrito, destacamos algunos de los pasos críticos involucrados en este procedimiento.

Protocol

El cuidado y uso de animales para este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Comunidad Europea (2010/63/UE). Los procedimientos experimentales fueron aprobados específicamente por el comité de ética del Institut Curie CEEA-IC #118 (autorización Nº 04395.03 dada por la Autoridad Nacional) en cumplimiento de las directrices internacionales. 1. Preparación de reactivos para purificación de tubulina NOTA: Todos los tampones utilizados para la…

Representative Results

El objetivo principal de este método es producir tubulina de alta calidad y competente para el montaje en cantidades suficientes para realizar experimentos in vitro repetidos con los componentes purificados. Los microtúbulos ensamblados a partir de esta tubulina se pueden utilizar en ensayos de reconstitución basados en la técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) con microtúbulos dinámicos o estables, en experimentos que prueban dinámicas de microtúbulos, interacciones con MAPs …

Discussion

El método descrito aquí proporciona una plataforma para generar rápidamente tubulina de alta calidad y competente para el montaje en cantidades medianas y grandes a partir de líneas celulares y cerebros de ratón único. Se basa en el protocolo estándar de oro de purificación de tubulina de cerebros bovinos utilizados en el campo durante muchos años^16,17. Una ventaja particular del enfoque es el uso de cultivos de suspensión de células HeLa S3, que, una …

Materials

1 M MgCl2	Sigma	#M1028
1-L cell culture vessels	Techne F7610		Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol	Sigma	#M3148	2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride	Sigma	#A8456
40% Acrylamide	Bio-Rad	#161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)	Sigma	#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10	Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa		dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	dilution: 1/20,000
Aprotinin	Sigma	#A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles			For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge			For collecting spinner cultures
Biological stirrer	Techne MCS-104L		Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide	Bio-Rad	#161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®			For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
Bromophenol blue	Sigma	#1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium	Life Technologies	#41965062
DTT, DL-Dithiothreitol	Sigma	#D9779
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma	#E3889
Ethanol absolute	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F7524
French pressure cell press	Thermo electron corporation	#FA-078A	with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol	VWR Chemicals	#24388.295
Glycine	Sigma	#G8898
GTP	Sigma	#G8877
Heating block	Stuart	#SBH130D
Hela cells		ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells	ATCC	ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )	VWR	#20252.290
Inverted microscope			With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
JLA-8.1000 rotor			For collecting spinner cultures
KOH	Sigma	#P1767	KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine	Life Technologies	#25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes	Sigma	4-16 K
Leupeptin	Sigma	#L2884
Liquid nitrogen
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles	Eppendorf	#0030 120.973
Mouse brain tissue			Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm	Terumo	#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm	Terumo	#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Life Technologies	#14190169
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	#P7626	PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES	Sigma	#P6757
Pipette-boy
Rotors	Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment	Bio-Rad	#1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate	VWR	#442444H	For preparing Laemmeli buffer
SDS, Sodium dodecyl sulphate	Sigma	#L5750	For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator	Branson	#101-148-070	Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma	#9281
Trichostatin A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma	#T9284
Trizma base (Tris)	Sigma	#T1503
Trypsin	Life Technologies	#15090046
Ultracentrifuge rotors		TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#357448	for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#349622	for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#355631	for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges	Beckman	Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders			Set at 30°C