중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화
Summary
이 프로토콜은 중합 및 중합 주기를 사용하여 배양 된 세포 또는 단일 마우스 뇌와 같은 중소 규모의 소스에서 튜룰린 정제를 설명합니다. 정제 된 튜룰린은 특정 동종형으로 풍부해지거나 특정 번역 후 변형을 가지며 체외 재관체 검사에서 미세 tubule 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
미세 투외 세포 골격의 연구의 한 가지 중요한 측면은 체외 재구성 실험에서 미세 tubule 행동의 조사입니다. 그(것)들은 역학과 같은 microtubules의 본질적인 속성의 분석및 microtubule 관련 단백질 (MAPs)와의 상호 작용을 허용합니다. “tubulin 코드”는 마이크로 튜블러 특성 및 기능의 조절자로서 다양한 튜룰린 동종 형 및 다양한 번역 후 변형 (PTM)을 가리키는 새로운 개념입니다. 튜룰린 코드의 분자 메커니즘을 탐구하려면 특정 동종 및 PTM을 사용하여 정제 된 튜룰린을 사용하여 체외 재구성 실험을 수행하는 것이 중요합니다.
현재까지, 이것은 널리 체외 실험에서 사용되는 뇌 튜룰린으로 기술적으로 도전했다, 많은 PTM을 항구하고 정의 된 동종 조성을 가지고. 따라서, 우리는 중합 및 비합화 주기의 고전적인 접근 방식을 사용하여, 다른 소스와 다른 등류 조성 및 제어 된 PTM로 튜룰린을 정화하기 위해이 프로토콜을 개발했다. 선호도 정화에 기초한 기존 방법에 비해, 이러한 접근법은 중합또는 중합화에 내성이 있는 튜룰린이 연속정화 단계에서 버려짐에 따라 순수하고 중합화능력이 있는 튜룰린을 산출한다.
우리는 현탁액또는 부착 배양으로 성장한 세포주에서 튜룰린의 정제를 설명하고 단일 마우스 뇌에서 설명합니다. 이 방법은 먼저 서스펜션 및 부착 설정 모두에서 세포 질량의 생성을 설명하고, 용해 단계, 중합-폴리머화 주기에 의한 튜룰린 정화의 연속적인 단계를 설명한다. 우리의 방법은 관련 단백질과의 마이크로 튜부 및 마이크로 튜블러 상호 작용의 본질적인 특성에 대한 튜룰린 코드의 영향을 다루는 실험에 사용할 수있는 tubulin을 산출합니다.
Introduction
마이크로튜브는 많은 세포 프로세스에서 중요한 역할을 합니다. 그(것)들은 세포에게 그들의 모양을 주고, 염색체 분리를 위한 메이오제 및 미토Tic 스핀들을 만들고, 세포내 수송을 위한 트랙역할을 합니다. 이러한 다양한 기능을 수행하기 위해 마이크로 튜버는 다른 방식으로 자신을 구성합니다. 이 분야의 흥미로운 질문 중 하나는 구조적으로 진화적으로 보존된 마이크로투블러가 조직과 기능의 이 과다에 적응할 수 있도록 하는 분자 메커니즘을 이해하는 것입니다. 한 가지 잠재적 메커니즘은‘튜룰린코드’1,2,3로알려진 개념에 의해 정의되는 마이크로투부의 다양화이다. tubulin 코드는 두 가지 주요 구성 요소를 포함: α-및 β-tubulin 유전자 제품의 차동 통합 (tubulin 등색형) 마이크로 튜부 및 튜룰린 번역 후 수정 (PTM).
1970년대 부터 진화하는 빛 현미경 기술과 결합된 체외 재헌법 실험은 미세투부의 특성에 대한 중요한 발견의 길을 열어주었습니다: 동적 불안정4 및 러닝머신5,그리고 그들의 다른메커니즘및 기능6,7,7,9,11,12,13, 14,14,15. 지금까지 수행된 거의 모든 체외 실험은 중합및 중합제의 반복주기를 사용하여 뇌 조직에서 정제된튜룰린(tubulin)에기초해 왔다16,17. 뇌 조직에서 정제하는 것은 대량(보통 그램 양)으로 고품질 튜룰린을 얻는 이점을 부여하지만, 뇌 조직에서 정제된 튜룰린이 다른 튜룰린 동종형의 혼합물이며 많은 튜룰린 PTM이 풍부하기 때문에 한 가지 중요한 단점은 이질성입니다. 이러한 이질성은 마이크로튜블러 특성 및 기능의 제어에서 특정 튜룰린 PTM 또는 동소형의 역할을 묘사하는 것을 불가능하게 합니다. 따라서, 조절된 튜룰린 PTM 및 균질동형 조성물을 가진 조립 유능한 튜룰린을 생산하는 것은 튜룰린 코드의 분자 메커니즘을 해결하는 데 필수적이다.
최근에는 효모 Stu2p의 마이크로투블러 결합 TOG(종양 과잉 발현 유전자) 도메인을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한 튜블러린을 정화하는 접근법이개발되었다. 이 방법에서, 세포 또는 조직의 조잡한 용해의 튜룰린은 주어진, 심지어 아주 작은, 샘플의 전체 tubulin 풀의 분석을 허용하는 매트릭스 고정 TOG 도메인에 결합하는 컬럼을 통해 전달된다. 재조합 튜룰린을 정화하기 위한 대망의 접근법도 최근 몇 년 동안 설명되어 있습니다. 그것은 α 및 β-tubulin 유전자를 포함하는 bi-cistronic 벡터가 곤충세포(19)에서발현되는 바쿨로바이러스 시스템을 기반으로 한다. 그러나, 이 방법은 매우 번거롭고 시간이 많이 소요되며, 따라서 주로 체외에서 튜룰린 돌연변이20 및 튜룰린 동소형21,22,23의 충격을 연구하기 위해 사용됩니다.
현재 프로토콜에서, 우리는 잘 확립되고 널리 사용되는 중합체-중합화 접근법을 세포주 또는 마우스 뇌조직(24)으로부터다른 수준의 변형으로 튜룰린을 생성하는 청사진으로 사용하는 방법을 설명한다. 이 절차에서, 튜룰린은 수용성(4°C의 튜룰린 이머)과 중합형(구아노신 5′-triphosphate[GTP]의 존재시 30°C의 마이크로튜블러)를 순환한다. 각 형태는 원심분리의 연속단계를 통해 분리된다: 튜룰린 조광기는 감기(4°C) 스핀 후 상부체에 남아 있는 반면, 마이크로튜부는 30°C에서 펠릿화된다. 더욱이, 하나의 중합 단계는 높은 piperazine-N,N-fis(2-에탄설포닉산) (PIPES) 농도에서 수행되며, 이는 마이크로투부에서 마이크로튜버 관련 단백질을 제거할 수 있게 해주며, 따라서, 최종 적으로 정제된 튜룰린으로부터 수행된다. 정지 또는 부착 배양으로 성장 한 HeLa S3 세포로부터 정제 된 Tubulin은 임의의 튜룰린 PTM이 거의 없으며 최근 시험관 내 재분학 실험25,26,27,28에서사용되어 왔다. 우리는 더 하나의 마우스 뇌에서 튜룰린을 정화하는 방법을 적응했다, 이는 튜룰린 등색형 및 PTM의 변화와 마우스 모델의 큰 숫자에 사용할 수 있습니다.
프로토콜에서, 우리는 먼저 원료의 생성을 설명 (세포 질량 또는 뇌 조직), 그것의 lysis(도 1A),튜룰린 중합 및 비합화의 연속 단계 다음 튜룰린정화(도 1B). 우리는 정제된 튜룰린의순도(도 2A, B)및 수량(도3A, B)을평가하는 과정을 더 설명한다. 상기 방법은 튜룰린정제(도 4B)에앞서 세포내 변형 효소를 과발현함으로써 선택된 PTM으로 농축된 튜룰린을 생성하도록 조정할 수 있다. 대안적으로, 튜룰린 변형 효소는 정화 과정에서 튜룰린에 첨가될 수 있다. 마지막으로, 해당 튜룰린 변형효소(도 4B)29에서부족한 쥐의 뇌로부터 특정 동소형 또는 PTM이 부족한 튜룰린을 정화할 수 있다.
여기서 설명하는 방법에는 두 가지 주요 장점이 있습니다: (i) 비교적 짧은 시간에 충분히 많은 양의 튜룰린을 생산할 수 있으며, (ii) 특정 튜룰린 동형 조성물 또는 PTM을 사용하여 고품질의 순수 튜룰린을 생성합니다. 이 원고의 관련 비디오에서는 이 절차와 관련된 몇 가지 중요한 단계를 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 방법은 세포주 및 단일 마우스 뇌에서 중량으로 고품질의 조립 능력이 있는 튜룰린을 신속하게 생성하는 플랫폼을 제공한다. 그것은 오랜 년 동안 분야에서 사용되는 소 뇌에서 튜룰린 정제의 금 표준 프로토콜을 기반으로16,17. 접근법의 한 가지 특별한 장점은 HeLa S3 세포의 현탁액 배양을 사용하는 것입니다. 이는 프로토콜이 임의의 세?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 및 Institut de 컨버전스 Q-life ANR-17-CONV-0005에 의해 지원되었습니다. CJ는 인스티투트 큐리의 지원을 받고 있습니다. 프랑스 국립연구청(ANR)은 ANR-12-BSV2-0007 및 ANR-17-CE13-0021, 인스티투트 국립 뒤암(INCA) 교부금 2014-PL BIO-11-ICR-1, 그리고 퐁당 부어 라 레쉐메디컬(FRM) 교부금 DEQ2010.30.16. MMM은 퐁도크 알츠하이머 보조금 FR-16055p에 의해 지원되며, 프랑스 알츠하이머 는 AAP SM을 부여 2019 n ° 2023. JAS는 마리 Skłodowska-Curie 보조금 협정 No 675737에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원되었으며, FRM 보조금 FDT201904008210. SB는 FRM 보조금 FDT201805005465에 의해 지원되었다.
우리는 Janke 연구소의 모든 구성원, 특히 J. 수프론뿐만 아니라 G. 라키치 (Institut MICALIS, AgroParisTech) 및 A. Gautreau (에콜 폴리 테크닉대학)의 프로토콜 설립 기간 동안 도움을 주셔서 감사합니다. 우리는 마우스 사육과 관리에 도움을 준 Institut Curie의 동물 시설에 감사드립니다.
J. 프랑켈과 M. 넬슨에 의해 개발 된 항체 12G10은 NICHD의 후원하에 개발된 개발 연구 하이브리드 종 은행에서 얻어졌고 아이오와 대학에 의해 유지되었습니다.
Materials
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
| 1.5- and 2-ml tubes | |||
| 14-ml round-bottom tubes | |||
| 15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
| 15-ml screw-cap tubes | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
| 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
| 5-, 10- 20-ml syringes | |||
| 5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
| 50-ml screw-cap tubes | |||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
| Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
| Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
| Balance (0.1 – 10 g) | |||
| Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
| Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
| Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
| Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
| Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
| Cell culture hood | |||
| Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
| DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
| DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
| French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
| Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glycine | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | #G8877 | |
| Heating block | Stuart | #SBH130D | |
| Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
| Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
| Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
| Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
| L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
| Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
| Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
| Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
| Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
| Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Life Technologies | #14190169 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
| pH-meter | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
| PIPES | Sigma | #P6757 | |
| Pipette-boy | |||
| Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
| SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
| Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
| Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
| Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
| Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
| Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
| Vortex mixer | |||
| Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |
References
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