Purificação de Tubulin com Modificações Pós-Translacionais Controladas e Isótipos de Fontes Limitadas por Ciclos de Polimerização-Despolimerização
Summary
Este protocolo descreve a purificação de tubulinas a partir de fontes de pequena/média escala, como células cultivadas ou cérebros de camundongos únicos, usando ciclos de polimerização e despomerização. A tubulina purificada é enriquecida em isótipos específicos ou tem modificações pós-transacionais específicas e pode ser usada em ensaios de reconstituição in vitro para estudar dinâmicas e interações de microtúbulos.
Abstract
Um aspecto importante dos estudos do citoesqueleto microtúbulo é a investigação do comportamento microtúbulo em experimentos de reconstituição in vitro. Permitem a análise das propriedades intrínsecas dos microtúbulos, como a dinâmica, e suas interações com proteínas associadas a microtúbulos (MAPs). O “código tubulina” é um conceito emergente que aponta diferentes isótipos de tubulina e várias modificações pós-transacionais (PTMs) como reguladores de propriedades e funções de microtúbulos. Para explorar os mecanismos moleculares do código tubulina, é crucial realizar experimentos de reconstituição in vitro usando tubulina purificada com isótipos específicos e PTMs.
Até hoje, isso foi tecnicamente desafiador como tubulina cerebral, que é amplamente utilizada em experimentos in vitro, abriga muitos PTMs e tem uma composição de isótipo definida. Assim, desenvolvemos este protocolo para purificar tubulina de diferentes fontes e com diferentes composições isótipos e PTMs controlados, utilizando a abordagem clássica dos ciclos de polimerização e despomerização. Em comparação com os métodos existentes baseados na purificação da afinidade, essa abordagem produz tubulina pura e competente para polimerização, uma vez que a tubulina resistente à polimerização ou despomerização é descartada durante as sucessivas etapas de purificação.
Descrevemos a purificação da tubulina das linhas celulares, cultivadas em suspensão ou como culturas aderentes, e de cérebros de camundongos únicos. O método descreve pela primeira vez a geração de massa celular tanto em configurações de suspensão quanto aderentes, a etapa de lise, seguida pelos sucessivos estágios de purificação da tubulina por ciclos de polimerização-despomerização. Nosso método produz tubulina que pode ser usada em experimentos que abordam o impacto do código tubulina nas propriedades intrínsecas de microtúbulos e interações microtúbulas com proteínas associadas.
Introduction
Os microtúbulos desempenham papéis críticos em muitos processos celulares. Eles dão às células sua forma, constroem fusos meioticos e mitóticos para segregação de cromossomo, e servem como trilhas para o transporte intracelular. Para desempenhar essas diversas funções, os microtúbulos se organizam de diferentes formas. Uma das questões intrigantes no campo é entender os mecanismos moleculares que permitem que os microtúbulos conservados estrutural e evolutivamente se adaptem a essa infinidade de organizações e funções. Um mecanismo potencial é a diversificação de microtúbulos, que é definido pelo conceito conhecido como ‘código tubulina’1,2,3. O código da tubulina inclui dois componentes principais: incorporação diferencial de produtos genéticos α e β-tubulin (isótipos de tubulina) nos microtúbulos e modificações pós-translationais de tubulina (PTMs).
Desde a década de 1970, experimentos de reconstituição in vitro, combinados com técnicas de microscopia de luz em evolução, abriram caminho para importantes descobertas sobre as propriedades dos microtúbulos: instabilidade dinâmica4 e esteira5, e seus outros mecanismos e funções6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Quase todos os experimentos in vitro realizados até agora foram baseados em tubulina purificada do tecido cerebral usando ciclos repetidos de polimerização e despomerização16,17. Embora a purificação do tecido cerebral confere a vantagem de obter tubulina de alta qualidade em grandes quantidades (geralmente quantidades gramais), uma desvantagem importante é a heterogeneidade como tubulina purificada do tecido cerebral é uma mistura de diferentes isótipos de tubulina e é enriquecida com muitos PTMs de tubulina. Essa heterogeneidade torna impossível delinear o papel de um determinado tubulin PTM ou isótipo no controle de propriedades e funções de microtúbulos. Assim, produzir tubulina competente para montagem com PTMs de tubulina controlada e composição homogênea do isótipo é essencial para abordar os mecanismos moleculares do código tubulina.
Recentemente, uma abordagem para purificar a tubulina por cromatografia de afinidade usando o domínio TOG (gene ultraexpresso de tumor) do domínio de levedura Stu2p foi desenvolvida18. Neste método, a tubulina em lises brutas de células ou tecidos é passada através de uma coluna onde se liga ao domínio TOG imobilizado de matriz, que permite a análise de toda a piscina de tubulina de uma determinada, mesmo muito pequena, amostra. Uma abordagem muito esperada para purificar a tubulina recombinante também foi descrita nos últimos anos. Baseia-se no sistema de baculovírus, no qual um vetor bi-cistrônico contendo genes α e β-tubulina é expresso em células de insetos19. No entanto, este método é muito complicado e demorado e, portanto, é usado principalmente para estudar o impacto das mutações de tubulina20 e isótipos de tubulina21,22,23 in vitro.
No protocolo atual, descrevemos um método que utiliza a abordagem de polimerização-despolimerização bem estabelecida e amplamente utilizada como um projeto para gerar tubulina com diferentes níveis de modificação, seja a partir de linhas celulares ou do tecido cerebral do rato24. Neste procedimento, a tubulina é ciclo entre o solúvel (tubulin dimer a 4 °C) e a forma polimerizada (microtúbulo a 30 °C na presença de guanosina 5′-triphosphate [GTP]). Cada forma é separada através de sucessivas etapas de centrifugação: os dimers de tubulina permanecerão no supernascer após um giro frio (4 °C), enquanto os microtúbulos serão pelotados a 30 °C. Além disso, uma etapa de polimerização é realizada na alta piperazina-N,N‘-bis (2-ácido etanolfônico) (PIPES), que permite a remoção de proteínas associadas a microtúbulos dos microtúbulos e, portanto, da tubulina finalmente purificada. Tubulin purificado de células HeLa S3 cultivadas como culturas suspensas ou aderentes está virtualmente livre de qualquer tubulina PTM e tem sido usada em recentes experimentos de reconstituição in vitro25,26,27,28. Adaptamos ainda mais o método para purificar tubulina de cérebros de camundongos únicos, que podem ser usados para um grande número de modelos de mouse com alterações em isótipos de tubulina e PTMs.
No protocolo, descrevemos pela primeira vez a geração do material de origem (massa celular ou tecido cerebral), sua lise (Figura 1A),seguida dos sucessivos passos de polimerização e despomerização da tubulina para purificar a tubulina (Figura 1B). Descrevemos ainda o processo para avaliar a pureza (Figura 2A,B) e a quantidade(Figura 3A,B) da tubulina purificada. O método pode ser adaptado para produzir tubulina enriquecida com um PTM selecionado, superexpressando uma enzima modificadora em células antes da purificação da tubulina(Figura 4B). Alternativamente, enzimas modificadoras de tubulina podem ser adicionadas à tubulina durante o processo de purificação. Finalmente, podemos purificar tubulinas sem isótipos específicos ou PTMs do cérebro de camundongos deficientes nas enzimas correspondentes modificadoras de tubulina(Figura 4B)29.
O método que descrevemos aqui tem duas principais vantagens: (i) permite a produção de quantidades suficientemente grandes de tubulina em um tempo relativamente curto, e (ii) gera tubulina pura e de alta qualidade, com composição específica de isótipo de tubulina ou PTMs. No vídeo associado deste manuscrito, destacamos algumas das etapas críticas envolvidas neste procedimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui fornece uma plataforma para gerar rapidamente tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades médias-grandes de linhas celulares e cérebros de camundongos únicos. Baseia-se no protocolo padrão-ouro da purificação de tubulinas de cérebros bovinos usados no campo por muitos anos16,17. Uma vantagem particular da abordagem é o uso de culturas de suspensão das células HeLa S3, que, uma vez estabelecidas, produzem …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo ANR-10-IDEX-0001-02, o LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 e o Institut de convergência Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ é apoiado pelo Institut Curie, a Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) concede ANR-12-BSV2-0007 e ANR-17-CE13-0021, o Institut National du Cancer (INCA) concede 2014-PL BIO-11-ICR-1, e a Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) concede de desconto deQ20170336756. O MMM é apoiado pela fondation vaincre Alzheimer grant FR-16055p, e pela França Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. A JAS foi apoiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 675737, e a concessão da FRM FDT201904008210. A SB foi apoiada pela subvenção FRM FDT201805005465.
Agradecemos a todos os membros do laboratório Janke, em especial J. Souphron, bem como g. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) e A. Gautreau (Ecole Polytechnique) pela ajuda durante a criação do protocolo. Gostaríamos de agradecer à instalação animal do Institut Curie pela ajuda com a criação e cuidado dos camundongos.
O anticorpo 12G10, desenvolvido por J. Frankel e M. Nelson, foi obtido do Banco hybridoma de estudos de desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa.
Materials
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
| 1.5- and 2-ml tubes | |||
| 14-ml round-bottom tubes | |||
| 15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
| 15-ml screw-cap tubes | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
| 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
| 5-, 10- 20-ml syringes | |||
| 5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
| 50-ml screw-cap tubes | |||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
| Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
| Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
| Balance (0.1 – 10 g) | |||
| Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
| Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
| Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
| Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
| Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
| Cell culture hood | |||
| Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
| DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
| DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
| French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
| Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glycine | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | #G8877 | |
| Heating block | Stuart | #SBH130D | |
| Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
| Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
| Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
| Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
| L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
| Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
| Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
| Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
| Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
| Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Life Technologies | #14190169 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
| pH-meter | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
| PIPES | Sigma | #P6757 | |
| Pipette-boy | |||
| Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
| SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
| Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
| Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
| Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
| Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
| Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
| Vortex mixer | |||
| Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |
References
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
- Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
- Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
- Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
- Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
- Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
- Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
- Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
- Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
- Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
- Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
- Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
- Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
- Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
- Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
- Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
- Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
- Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
- Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
- Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
- Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
- Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
- Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
- Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
- Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).
