Очистка Тубулина с контролируемыми посттрансляционными модификациями и изотипами из ограниченных источников по циклам полимеризации-деполимеризации
Summary
Этот протокол описывает очистку тубулина из малых/средних источников, таких как культурные клетки или мозг одной мыши, используя циклы полимеризации и деполимеризации. Очищенный тубулин обогащается в конкретных изотипах или имеет специфические посттрансляционные модификации и может быть использован в анализах восстановления in vitro для изучения динамики и взаимодействий микротрубочек.
Abstract
Одним из важных аспектов исследований цитоскелета микротрубочек является исследование поведения микротрубочек в экспериментах по восстановлению в пробирке. Они позволяют анализ внутренних свойств микротрубочек, таких как динамика, и их взаимодействия с микротрубочками связанных белков (MAPs). “Трубулин код” является новой концепцией, которая указывает на различные изотипы тубулина и различные посттрансляционные модификации (ПТМ) в качестве регуляторов свойств и функций микротрубочек. Для изучения молекулярных механизмов кода тубулина крайне важно проводить эксперименты по восстановлению в пробирке с использованием очищенного тубулина с конкретными изотипами и ПТМ.
На сегодняшний день, это было технически сложной задачей, как мозг тубулин, который широко используется в экспериментах in vitro, гавани многих PTMs и имеет определенный состав изотипа. Поэтому мы разработали этот протокол для очистки тубулина из разных источников и с различными изотипными композициями и контролируемыми ПТМ, используя классический подход циклов полимеризации и деполимеризации. По сравнению с существующими методами, основанными на сродстве очистки, этот подход дает чистый, полимеризации компетентных тубулин, как тубулин устойчивы к полимеризации или деполимеризации отбрасывается в ходе последовательных шагов очистки.
Мы описываем очищение тубулина от клеточных линий, выращенных либо в суспензии, либо как культуры адептов, так и из мозгов одной мыши. Метод сначала описывает генерацию массы клеток как в условиях подвески, так и в настройках адепта, этап лиза, за которым следуют последовательные этапы очистки тубулина циклами полимеризации-деполимеризации. Наш метод дает тубулин, который может быть использован в экспериментах, касаясь влияния кода тубулина на внутренние свойства микротрубочек и микротрубочек взаимодействия с сопутствующими белками.
Introduction
Микротрубоконы играют важную роль во многих клеточных процессах. Они придают клеткам свою форму, строят мейотические и митотические шпиндели для хромосомной сегрегации и служат следами внутриклеточного транспорта. Для выполнения этих разнообразных функций микротрубоконы организуются по-разному. Один из интригующих вопросов в этой области заключается в том, чтобы понять молекулярные механизмы, которые позволяют структурно и эволюционно сохраненных микротрубочек адаптироваться к этому множеству организаций и функций. Одним из потенциальных механизмов является диверсификация микротрубочек, которая определяется понятием, известным как «трубулин код»1,2,3. Код тубулина включает в себя два основных компонента: дифференциальное включение α- и β-тубулиных генных продуктов (трубулиновых изотипов) в микротрубобулы и трубулиновые посттрансляционные модификации (ПТМ).
С 1970-х годов эксперименты по восстановлению в пробирке, в сочетании с развивающимися методами световой микроскопии, проложили путь для важных открытий о свойствах микротрубочек:динамическая нестабильность 4 и беговая дорожка 5, иих другие механизмы и функции 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Почти все эксперименты in vitro, выполненные до сих пор, были основаны на тубулине, очищенном от ткани мозга с использованием повторных циклов полимеризациии деполимеризации 16,17. Хотя очищение от ткани мозга дает преимущество получения высококачественного тубулина в больших количествах (обычно граммовых количествах), одним из важных недостатков является неоднородность, так как тубулин, очищенный из тканей мозга, представляет собой смесь различных тобулиных изотипов и обогащен многими тубулиными ПТМ. Такая неоднородность не позволяет разграничить роль конкретного тубулина PTM или изотипа в управлении свойствами и функциями микротрубочек. Таким образом, для решения молекулярных механизмов трубулинового кода необходимо производить сборочно-компетентный тубулин ПТМ и однородный изотипный состав.
Недавно был разработан подход к очищению тубулина с помощью хроматографии с использованием микротрубочек-связывающих TOG (опухолево-переэкспрессивного гена)дрожжейStu2p. В этом методе тубулин в сырых лизах клеток или тканей проходит через столбец, где он связывается с матрично-иммобилизованным доменом TOG, что позволяет анализ всего пула тубулина данного, даже очень маленького, образца. В последние годы также был описан долгожданный подход к очистке рекомбинантного тубулина. Он основан на бакуловирусной системе, в которой в клетках насекомых19α-β двухтубулиновых генов. Тем не менее, этот метод является очень громоздким и трудоемким и поэтому в основном используется для изучениявоздействия мутаций тубулина 20 и трубулинизотипов 21,22,23 in vitro.
В текущем протоколе мы описываем метод, который использует хорошо затвердевшей и широко используемый подход полимеризации-деполимеризации как план для генерации тубулина с различными уровнями модификации либо из клеточных линий, либо изткани мозга мыши 24. В этой процедуре тубулин циклически циклически проносят между растворимым (тубулиновый димер при 4 градусов по Цельсию) и полимеризованной формой (микротрубочка при 30 градусов по Цельсию при наличии гуанозина 5′-трифосфата (ГТП). Каждая форма отделяется последовательными шагами центрифугации: тубулинский димеры останутся в супернатанте после холодного (4 градусов по Цельсию) спина, в то время как микротрубоколы будут гранулироваться при 30 градусах Цельсия. Кроме того, один шаг полимеризации осуществляется при высокой концентрациипиперазина-N,N-бис(2-этанесульфоновая кислота) (PIPES), что позволяет удалить микротрубочные белки из микротрубочек и, таким образом, из окончательно очищенного тубулина. Тубулин очищены от HeLa S3 клетки, выращенные в качестве подвески или адепт культур практически не имеет каких-либо тубулин PTM и был использован в последние экспериментыэкстракорпорального восстановления 25,26,27,28. Мы также адаптировали метод очистки тубулина от мозгов одной мыши, который может быть использован для большого количества моделей мышей с изменениями в изотипах тубулина и ПТМ.
В протоколе мы сначала описываем генерацию исходных материалов (клеточной массы или мозговой ткани), его лиза(рисунок 1A),а затем последовательные шаги полимеризации тубулина и деполимеризации для очистки тубулина(рисунок 1B). Далее мы описываем процесс оценки чистоты(рисунок 2A,B)и количества(рисунок 3A,B) очищенного тубулина. Метод может быть адаптирован для производства тубулина, обогащенного выбранным PTM путем переэкспрессирования изменяемого фермента в клетках до очистки тубулина(рисунок 4B). Кроме того, в процессе очистки в тубулин можно добавить ферменты, изменяющие тубулин. Наконец, мы можем очистить тубулин без конкретных изотипов или ПТМ из мозга мышей, не хватает соответствующих тубулин-изменяющих ферментов (рисунок 4B)29.
Метод, который мы описываем здесь, имеет два основных преимущества: i) он позволяет за относительно короткое время произвести достаточно большое количество тубулина, и ii) он генерирует высококачественный, чистый тубулин, либо с специфическим составом изотипа тубулина, либо с ПТМ. В связанном видео этой рукописи мы подчеркиваем некоторые из важнейших шагов, связанных с этой процедурой.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь метод обеспечивает платформу для быстрого генерации высококачественных, сборочных трубулинов в средних больших количествах из клеточных линий и мозгов одной мыши. Он основан на золотом стандартном протоколе очистки тубулина от бычьего мозга, используемого в поле<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 и Институт конвергенции NO-жизни ANR-17-CONV-0005. CJ поддерживается Институтом Кюри, Французское национальное исследовательское агентство (ANR) присуждает ANR-12-BSV2-0007 и ANR-17-CE13-0021, Грант Института национального рака (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1, и Фонд за Recherche Medicale (FRM) грант DE’20170336756. МММ поддерживается Фондом Vaincre Альцгеймера грант FR-16055p, и Франция Альцгеймера грант AAP SM 2019 n’2023. JAS была поддержана научно-исследовательской и инновационной программой Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Мари Склодовской-Кюри No 675737 и грантом FRM FDT201904008210. SB был поддержан грантом FRM FDT201805005465.
Мы благодарим всех сотрудников лаборатории Janke, в частности Дж.Супхрона, а также Г. Лакисича (Институт MICALIS, AgroParisTech) и А. Гаутреу (Политехническая школа) за помощь при создании протокола. Мы хотели бы поблагодарить животноводию Института Кюри за помощь в разведении и уходе за мышами.
Антитело 12G10, разработанное J. Frankel и M. Нельсон, было получено из развития исследований Hybridoma банка, разработанного под эгидой NICHD и поддерживается Университетом штата Айова.
Materials
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
| 1.5- and 2-ml tubes | |||
| 14-ml round-bottom tubes | |||
| 15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
| 15-ml screw-cap tubes | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
| 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
| 5-, 10- 20-ml syringes | |||
| 5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
| 50-ml screw-cap tubes | |||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
| Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
| Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
| Balance (0.1 – 10 g) | |||
| Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
| Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
| Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
| Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
| Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
| Cell culture hood | |||
| Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
| DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
| DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
| French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
| Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glycine | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | #G8877 | |
| Heating block | Stuart | #SBH130D | |
| Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
| Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
| Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
| Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
| L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
| Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
| Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
| Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
| Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
| Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Life Technologies | #14190169 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
| pH-meter | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
| PIPES | Sigma | #P6757 | |
| Pipette-boy | |||
| Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
| SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
| Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
| Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
| Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
| Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
| Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
| Vortex mixer | |||
| Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |
References
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
- Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
- Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
- Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
- Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
- Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
- Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
- Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
- Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
- Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
- Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
- Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
- Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
- Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
- Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
- Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
- Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
- Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
- Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
- Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
- Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
- Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
- Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
- Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
- Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).
