पॉलीमर्ाइजेशन-डेपोलिमराइजेशन चक्रों द्वारा सीमित स्रोतों से नियंत्रित पोस्टट्रांसलाइजेशनल संशोधनों और आइसोटाइप के साथ ट्यूबलिन का शुद्धिकरण
Summary
यह प्रोटोकॉल बहुभाषी कोशिकाओं या एकल माउस दिमाग जैसे छोटे/मध्यम पैमाने के स्रोतों से ट्यूबुलिन शुद्धिकरण का वर्णन करता है, बहुलीकरण और depolymerization चक्र का उपयोग कर । शुद्ध ट्यूबुलिन विशिष्ट आइसोटाइप में समृद्ध है या विशिष्ट पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों में है और माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और बातचीत का अध्ययन करने के लिए विट्रो पुनर्गठन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
माइक्रोटुबुल साइटोस्केलेटन के अध्ययन का एक महत्वपूर्ण पहलू इन विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों में माइक्रोटुबुल व्यवहार की जांच है। वे माइक्रोट्यूबुल के आंतरिक गुणों के विश्लेषण की अनुमति देते हैं, जैसे गतिशीलता, और माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन (एमएपी) के साथ उनकी बातचीत। “ट्यूबलिन कोड” एक उभरती हुई अवधारणा है जो माइक्रोट्यूबुल गुणों और कार्यों के नियामकों के रूप में विभिन्न ट्यूबलिन आइसोटाइप और विभिन्न पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) को इंगित करती है। ट्यूबलिन कोड के आणविक तंत्र का पता लगाने के लिए, विशिष्ट आइसोटाइप और पीटीएमएस के साथ शुद्ध ट्यूबलिन का उपयोग करके विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों में प्रदर्शन करना महत्वपूर्ण है।
आज तक, यह मस्तिष्क ट्यूबलिन के रूप में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण था, जिसका व्यापक रूप से इन विट्रो प्रयोगों में उपयोग किया जाता है, कई पीटीएमएस बंदरगाहों और एक परिभाषित आइसोटाइप संरचना है। इसलिए, हमने बहुभाषण और नियंत्रण चक्रों के शास्त्रीय दृष्टिकोण का उपयोग करके विभिन्न स्रोतों से और विभिन्न आइसोटाइप रचनाओं और नियंत्रित पीटीएमएस के साथ ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए इस प्रोटोकॉल को विकसित किया। आत्मीयता शुद्धि के आधार पर मौजूदा तरीकों की तुलना में, यह दृष्टिकोण शुद्ध, बहुलकीकरण-सक्षम ट्यूबलिन की पैदावार करता है, क्योंकि लगातार शुद्धिकरण चरणों के दौरान पॉलीमराइजेशन या अपोलिमराइजेशन के लिए ट्यूबलिन प्रतिरोधी को छोड़ दिया जाता है।
हम सेल लाइनों से ट्यूबलिन की शुद्धि का वर्णन करते हैं, या तो निलंबन में या अनुयायी संस्कृतियों के रूप में उगाए जाते हैं, और एकल माउस दिमाग से। विधि पहले निलंबन और अनुयायी सेटिंग्स, लाइसिस चरण दोनों में सेल द्रव्यमान की पीढ़ी का वर्णन करती है, जिसके बाद बहुलीकरण-अप्लीमराइजेशन चक्रों द्वारा ट्यूबलिन शुद्धिकरण के क्रमिक चरणों का वर्णन किया जाता है। हमारी विधि ट्यूबलिन पैदा करती है जिसका उपयोग माइक्रोट्यूबुल्स के आंतरिक गुणों और संबंधित प्रोटीन के साथ माइक्रोट्यूबुले इंटरैक्शन पर ट्यूबुलिन कोड के प्रभाव को संबोधित करने वाले प्रयोगों में किया जा सकता है।
Introduction
माइक्रोट्यूबुल कई सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते हैं। वे कोशिकाओं को अपना आकार देते हैं, गुणसूत्र अलगाव के लिए मेयोटिक और माइटोटिक स्पिंडल बनाते हैं, और इंट्रासेलुलर परिवहन के लिए पटरियों के रूप में काम करते हैं। इन विविध कार्यों को करने के लिए, माइक्रोट्यूबुल खुद को विभिन्न तरीकों से व्यवस्थित करते हैं। क्षेत्र में पेचीदा सवालों में से एक आणविक तंत्र को समझना है जो संरचनात्मक और विकासवादी रूप से संरक्षित माइक्रोट्यूबुल को संगठनों और कार्यों की इस अधिकता के अनुकूल बनाने की अनुमति देता है। एक संभावित तंत्र माइक्रोट्यूबुल्स का विविधीकरण है, जिसे‘ट्यूबलिन कोड’1,2,3के रूप में जाना जाने वाली अवधारणा द्वारा परिभाषित किया गया है। ट्यूबलिन कोड में दो प्रमुख घटक शामिल हैं: माइक्रोट्यूबुल्स और ट्यूबलिन पोस्टट्रांसलेक्शनल संशोधनों (पीटीएमएस) में α और β-ट्यूबुलिन जीन उत्पादों (ट्यूबलिन आइसोटाइप) का अंतर समावेश।
1 9 70 के दशक से, विकसित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ मिलकर विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों ने सूक्ष्मतुबलों के गुणों के बारे में महत्वपूर्ण खोजों का मार्ग प्रशस्त किया है: गतिशील अस्थिरता4 और ट्रेडमिलिंग5,और उनके अन्य तंत्रऔर कार्य6,7,8,9,10,11,12,13,14,15। अब तक किए गए लगभग सभी इन विट्रो प्रयोग मस्तिष्क के ऊतकों से शुद्ध ट्यूबलिन पर आधारित रहे हैं , जिनमें पॉलीमराइजेशन और16,17के बार – बार चक्रों का उपयोग किया गया है । यद्यपि मस्तिष्क के ऊतकों से शुद्धि बड़ी मात्रा (आमतौर पर ग्राम मात्रा) में उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूबलिन प्राप्त करने का लाभ प्रदान करती है, एक महत्वपूर्ण दोष विषमता है क्योंकि मस्तिष्क के ऊतकों से शुद्ध ट्यूबलिन विभिन्न ट्यूबलिन आइसोटाइप का मिश्रण है और कई ट्यूबलिन पीटीएम से समृद्ध है। यह विषमता माइक्रोट्यूबुल गुणों और कार्यों के नियंत्रण में एक विशेष ट्यूबलिन पीटीएम या आइसोटाइप की भूमिका को चित्रित करना असंभव बना देती है। इस प्रकार, ट्यूबलिन कोड के आणविक तंत्र को संबोधित करने के लिए नियंत्रित ट्यूबलिन पीटीएमएस और समरूप आइसोटाइप संरचना के साथ असेंबली-सक्षम ट्यूबलिन का उत्पादन आवश्यक है।
हाल ही में, खमीर Stu2p के माइक्रोट्यूबुले-बाध्यकारी टोग (ट्यूमर-ओवरएक्सप्रेस्ड जीन) डोमेन का उपयोग करके आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी द्वारा ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया गयाहै। इस विधि में, कोशिकाओं या ऊतकों के कच्चे तेल के लंग्स में ट्यूबुलिन को एक कॉलम के माध्यम से पारित किया जाता है जहां यह मैट्रिक्स-स्थिर टोग डोमेन से बांधता है, जो किसी दिए गए, यहां तक कि बहुत छोटे, नमूने के पूरे ट्यूबलिन पूल के विश्लेषण की अनुमति देता है। हाल के वर्षों में पुनर्संयोजन ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए एक लंबे समय से प्रतीक्षित दृष्टिकोण का भी वर्णन किया गया है । यह बाकुलोवायरस प्रणाली पर आधारित है, जिसमें α और β-ट्यूबलिन जीन युक्त एक द्वि-सिस्ट्रोनिक वेक्टर कीट कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है19। हालांकि, यह विधि बहुत बोझिल और समय लेने वाली है और इसलिए ज्यादातर ट्यूबलिन म्यूटेशन 20 और ट्यूबलिन आइसोटाइप21, 22, 23इन विट्रो के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग कियाजाता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो सेल लाइनों से या माउस मस्तिष्क ऊतक24से संशोधन के विभिन्न स्तरों के साथ ट्यूबलिन उत्पन्न करने के लिए एक ब्लूप्रिंट के रूप में अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले बहुलीकरण-depolymerization दृष्टिकोण का उपयोग करता है। इस प्रक्रिया में, ट्यूबुलिन को घुलनशील (4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबुलिन डिमर) और पॉलीमराइज्ड फॉर्म (गुआनोसिन 5′-ट्रिप्होस्फेट [जीटीपी] की उपस्थिति में 30 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोट्यूबुले के बीच साइकिल किया जाता है। प्रत्येक रूप को अपकेंद्रित्र के क्रमिक चरणों के माध्यम से अलग किया जाता है: ट्यूबलिन डिमर्स सर्दी (4 डिग्री सेल्सियस) स्पिन के बाद सुपरनैंट में रहेंगे, जबकि माइक्रोट्यूबुल्स को 30 डिग्री सेल्सियस पर गोली मार दी जाएगी। इसके अलावा, एक बहुलककरण कदम उच्च पिपराज़ीन-एन,एन′-बीआईएस (2-एथेलसुल्फोनिक एसिड) (पाइप) एकाग्रता पर किया जाता है, जो माइक्रोट्यूबुल से माइक्रोटुबुल से जुड़े प्रोटीन को हटाने की अनुमति देता है और इस प्रकार, अंत में शुद्ध ट्यूबुलिन से। हेला एस 3 कोशिकाओं से प्यूरीफलिन को निलंबित या अनुयायी संस्कृतियों के रूप में उगाया जाता है, यह किसी भी ट्यूबलिन पीटीएम से लगभग मुक्त है और इसका उपयोग हाल ही में विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों में किया गया है25,27, 27,28. हमने एकल माउस दिमाग से ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए विधि को और अनुकूलित किया है, जिसका उपयोग बड़ी संख्या में माउस मॉडल के लिए ट्यूबुलिन आइसोटाइप और पीटीएमएस में परिवर्तन के साथ किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में, हम सबसे पहले स्रोत सामग्री (सेल द्रव्यमान या मस्तिष्क ऊतक), इसकी लाइसिस(चित्रा 1A)की पीढ़ी का वर्णन करते हैं, जिसके बाद ट्यूबलिन बहुलीकरण और विरूपण के क्रमिक चरणों के बाद ट्यूबलिन(चित्रा 1 बी)को शुद्ध किया जा सकता है। हम शुद्ध ट्यूबलिन की शुद्धता(चित्रा 2ए, बी)और मात्रा(चित्र 3ए, बी)का आकलन करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इस विधि को ट्यूबुलिन शुद्धिकरण(चित्रा 4 बी)से पहले कोशिकाओं में एक संशोधित एंजाइम को अधिकएक्सप्रेस करके चयनित पीटीएम के साथ समृद्ध ट्यूबलिन का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान ट्यूबलिन में ट्यूबलिन-संशोधित एंजाइमों को जोड़ा जा सकता है। अंत में, हम ट्यूबुलिन-संशोधित एंजाइमों(चित्रा 4B)29में चूहों की कमी चूहों के दिमाग से विशिष्ट आइसोटाइप या पीटीएमएस की कमी को शुद्ध कर सकते हैं।
हम यहां जिस विधि का वर्णन करते हैं उसके दो मुख्य फायदे हैं: (i) यह अपेक्षाकृत कम समय में पर्याप्त रूप से बड़ी मात्रा में ट्यूबलिन के उत्पादन की अनुमति देता है, और (ii) यह उच्च गुणवत्ता वाले, शुद्ध ट्यूबलिन उत्पन्न करता है, या तो विशिष्ट ट्यूबुलिन आइसोटाइप संरचना या पीटीएमएस के साथ। इस पांडुलिपि के संबद्ध वीडियो में, हम इस प्रक्रिया में शामिल कुछ महत्वपूर्ण कदमों को उजागर करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित विधि सेल लाइनों और एकल माउस दिमाग से मध्यम-बड़ी मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले, विधानसभा-सक्षम ट्यूबलिन को तेजी से उत्पन्न करने के लिए एक मंच प्रदान करती है। यह कई वर्षों के लिए क्षेत्र में इ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एएनआर-10-आईडीईएक्स-0001-02, लैबएक्स सेल’एन scale ANR-11-LBX-0038 और इंस्टीटयूट डी कन्वर्जेंस क्यू-लाइफ एएनआर-17-CONV-0005 द्वारा समर्थित किया गया था। सीजे को इंस्टीटयूट क्यूरी द्वारा समर्थित किया जाता है, फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) पुरस्कार ANR-12-BSV2-0007 और ANR-17-CE13-0021, संस्थान राष्ट्रीय du Cancer (INCA) अनुदान २०१४-PL जैव-11-आईसीआर-1, और Fondation डालना ला Recherche Medicale (FRM) अनुदान DEQ217033676 । एमएमएम को प्रियतम वैंके अल्जाइमर ग्रांट एफआर-16055p और फ्रांस अल्जाइमर ग्रांट AAP एसएम 2019 एन ° 2023 द्वारा समर्थित किया गया है। जेएएस को मैरी स्क्लोडोस्का-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 675737 के तहत यूरोपियन यूनियन के क्षितिज 2020 रिसर्च एंड इनोवेशन प्रोग्राम और एफआरएम ग्रांट FDT201904008210 द्वारा समर्थित किया गया था। एसबी को एफआरएम ग्रांट एफडीटी201805005465 का समर्थन मिला।
हम प्रोटोकाल की स्थापना के दौरान मदद के लिए जानकी लैब के सभी सदस्यों, विशेष रूप से जे सूपरॉन के साथ-साथ जी लाडिसिक (इंस्टीटयूट माइकालिस, एग्रोपरिअलिस) और ए गौट्रेऊ (इकोले पॉलीटेक्निक) को धन्यवाद देते हैं। हम माउस प्रजनन और देखभाल के साथ मदद के लिए इंस्टीटयूट क्यूरी की पशु सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
जे फ्रेंकेल और एम नेल्सन द्वारा विकसित एंटीबॉडी 12G10, एनआईसीएचडी के तत्वावधान में विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त किया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा बनाए रखा गया था।
Materials
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
| 1.5- and 2-ml tubes | |||
| 14-ml round-bottom tubes | |||
| 15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
| 15-ml screw-cap tubes | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
| 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
| 5-, 10- 20-ml syringes | |||
| 5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
| 50-ml screw-cap tubes | |||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
| Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
| Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
| Balance (0.1 – 10 g) | |||
| Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
| Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
| Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
| Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
| Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
| Cell culture hood | |||
| Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
| DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
| DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
| French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
| Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glycine | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | #G8877 | |
| Heating block | Stuart | #SBH130D | |
| Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
| Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
| Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
| Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
| L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
| Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
| Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
| Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
| Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
| Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Life Technologies | #14190169 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
| pH-meter | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
| PIPES | Sigma | #P6757 | |
| Pipette-boy | |||
| Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
| SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
| Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
| Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
| Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
| Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
| Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
| Vortex mixer | |||
| Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |
References
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