Rensing av Tubulin med kontrollerte posttranslasjonelle modifikasjoner og isotyper fra begrensede kilder ved polymerisering-depolymeriseringssykluser

Summary

Denne protokollen beskriver tubulinrensing fra små/mellomstore kilder som dyrkede celler eller enkeltmushjerner, ved hjelp av polymerisasjons- og depolymeriseringssykluser. Den rensede tubulinen er beriket i spesifikke isotyper eller har spesifikke posttranslasjonelle modifikasjoner og kan brukes i in vitro rekonstitueringsanalyser for å studere mikrotubuldynamikk og interaksjoner.

Abstract

Et viktig aspekt ved studier av mikrotubul cytoskeleton er undersøkelse av mikrotubul atferd i in vitro rekonstitueringseksperimenter. De tillater analyse av de iboende egenskapene til mikrotubuler, som dynamikk, og deres interaksjoner med mikrotubule-assosierte proteiner (MAPer). “Tubulin-koden” er et fremvoksende konsept som peker på forskjellige tubulinisotyper og ulike posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMer) som regulatorer av mikrotubule egenskaper og funksjoner. For å utforske de molekylære mekanismene i tubulinkoden, er det avgjørende å utføre in vitro rekonstitueringsforsøk ved hjelp av renset tubulin med spesifikke isotyper og PTMer.

Til dags dato var dette teknisk utfordrende som hjerne tubulin, som er mye brukt i in vitro eksperimenter, havner mange PTMer og har en definert isotype sammensetning. Derfor utviklet vi denne protokollen for å rense tubulin fra forskjellige kilder og med forskjellige isotypesammensetninger og kontrollerte PTMer, ved hjelp av den klassiske tilnærmingen til polymerisasjon og depolymeriseringssykluser. Sammenlignet med eksisterende metoder basert på affinitetsrensing, gir denne tilnærmingen ren, polymerisasjons-kompetent tubulin, da tubulinresistent mot polymerisering eller depolymerisering kastes under de påfølgende rensetrinnene.

Vi beskriver rensing av tubulin fra cellelinjer, vokst enten i suspensjon eller som tilhengerkulturer, og fra enkeltmushjerner. Metoden beskriver først genereringen av cellemasse i både suspensjons- og tilhengerinnstillinger, lysistrinnet, etterfulgt av de påfølgende stadiene av tubulinrensing ved polymeriseringsdepolymeriseringssykluser. Vår metode gir tubulin som kan brukes i eksperimenter som adresserer virkningen av tubulinkoden på de iboende egenskapene til mikrotubuler og mikrotubulinteraksjoner med tilknyttede proteiner.

Introduction

Mikrotubuler spiller kritiske roller i mange cellulære prosesser. De gir cellene sin form, bygger meiotiske og mitotiske spindler for kromosomsegregering, og tjener som spor for intracellulær transport. For å utføre disse forskjellige funksjonene organiserer mikrotubuler seg på forskjellige måter. Et av de spennende spørsmålene på feltet er å forstå de molekylære mekanismene som gjør at de strukturelt og evolusjonært bevarte mikrotubulene kan tilpasse seg denne mengden organisasjoner og funksjoner. En potensiell mekanisme er diversifisering av mikrotubuler, som er definert av konseptet kjent som ‘tubulinkoden’^1,2,3. Tubulinkoden inneholder to hovedkomponenter: differensialinkorporering av α- og β-tubulingenprodukter (tubulinisotyper) i mikrotubulene og tubulin posttranslational modifikasjoner (PTMer).

Siden 1970-tallet har in vitro rekonstitueringsforsøk, kombinert med utviklende lysmikroskopiteknikker, banet vei for viktige funn om egenskapene til mikrotubuler: dynamisk ustabilitet⁴ og tredemølle⁵, og deres andre mekanismer og funksjoner^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Nesten alle in vitro-forsøkene som er utført så langt, har vært basert på tubulin renset fra hjernevev ved hjelp av gjentatte sykluser av polymerisering og depolymerisering^16,17. Selv om rensing fra hjernevevet gir fordelen av å skaffe høykvalitets tubulin i store mengder (vanligvis grammengder), er en viktig ulempe heterogeniteten som tubulin renset fra hjernevev er en blanding av forskjellige tubulin isotyper og er beriket med mange tubulin PTMs. Denne heterogeniteten gjør det umulig å avgrense rollen til en bestemt tubulin PTM eller isotype i kontroll av mikrotubule egenskaper og funksjoner. Dermed er det viktig å produsere monterings kompetent tubulin med kontrollerte tubulin PTMer og homogen isotypesammensetning for å adressere molekylmekanismene til tubulinkoden.

Nylig har en tilnærming for å rense tubulin ved affinitetskromatografi ved hjelp av det mikrotubule-bindende TOG -domenet (tumor-overekspressert gen) av gjær Stu2p blitt utviklet¹⁸. I denne metoden overføres tubulin i rå lysater av celler eller vev gjennom en kolonne der den binder seg til det matrise-immobiliserte TOG-domenet, noe som gjør det mulig å analysere hele tubulinbassenget til en gitt, til og med veldig liten prøve. En etterlengtet tilnærming for å rense rekombinant tubulin har også blitt beskrevet de siste årene. Den er basert på baculovirussystemet, der en bi-cistronic vektor som inneholder α- og β-tubulingener uttrykkes i insektceller¹⁹. Denne metoden er imidlertid veldig tungvint og tidkrevende og brukes derfor mest til å studere effekten av tubulinmutasjoner²⁰ og tubulin isotyper^21,22,23 in vitro.

I den nåværende protokollen beskriver vi en metode som bruker den veletablerte og mye brukte polymerisasjonsdepolymeriseringsmetoden som en blåkopi for å generere tubulin med forskjellige nivåer av modifikasjon enten fra cellelinjer eller fra musens hjernevev²⁴. I denne prosedyren sykles tubulin mellom den oppløselige (tubulin dimer ved 4 °C) og polymerisert form (mikrotubul ved 30 °C i nærvær av guanosin 5′-tripfosfat [GTP]). Hver form er skilt gjennom påfølgende trinn i sentrifugering: tubulin dimers vil forbli i supernatanten etter et kaldt (4 °C) spinn, mens mikrotubuler vil bli pelletert ved 30 °C. Videre utføres ett polymerisasjonstrinn ved høy piperazin-N,N′-bis(2-etesulfonsyre) (PIPES) konsentrasjon, noe som gjør det mulig å fjerne mikrotubule-assosierte proteiner fra mikrotubulene og dermed fra den endelig rensede tubulin. Tubulin renset fra HeLa S3 celler vokst som suspensjon eller tilhenger kulturer er nesten fri for noen tubulin PTM og har blitt brukt i nyere in vitro rekonstituering eksperimenter^25,26,27,28. Vi har videre tilpasset metoden for å rense tubulin fra enkeltmushjerner, som kan brukes til et stort antall musemodeller med endringer i tubulinistyper og PTMer.

I protokollen beskriver vi først genereringen av kildematerialet (cellemasse eller hjernevev), dets lysis (figur 1A), etterfulgt av de påfølgende trinnene for tubulinpolymerisering og depolymerisering for å rense tubulinen (figur 1B). Vi beskriver videre prosessen for å vurdere renheten (figur 2A, B) og mengden ( figur3A,B) av den rensede tubulinen. Metoden kan tilpasses for å produsere tubulin beriket med en valgt PTM ved å overtrykke et modifiserende enzym i celler før tubulinrensing (figur 4B). Alternativt kan tubulinmodifiserende enzymer legges til tubulin under renseprosessen. Til slutt kan vi rense tubulin som mangler spesifikke isotyper eller PTMer fra hjernen til mus som mangler i de tilsvarende tubulinmodifiserende enzymene (Figur 4B)²⁹.

Metoden vi beskriver her har to hovedfordeler: (i) det tillater produksjon av tilstrekkelig store mengder tubulin på relativt kort tid, og (ii) det genererer ren tubulin av høy kvalitet, med enten spesifikk tubulin isotypesammensetning eller PTMer. I den tilknyttede videoen av dette manuskriptet fremhever vi noen av de kritiske trinnene som er involvert i denne prosedyren.

Protocol

Dyrepleie og bruk for denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene fra Det europeiske fellesskap (2010/63/UE). Eksperimentelle prosedyrer ble spesifikt godkjent av etikkkomiteen i Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisasjon nr. 04395.03 gitt av National Authority) i samsvar med de internasjonale retningslinjene. 1. Utarbeidelse av reagenser for Tubulin Rensing MERK: Alle bufferne som brukes til tubulinrensing bør inneholde kaliumsalter og IKKE natriumsalter<su…

Representative Results

Hovedmålet med denne metoden er å produsere monterings kompetent tubulin av høy kvalitet i mengder som er tilstrekkelig til å utføre gjentatte in vitro-eksperimenter med de rensede komponentene. Mikrotubuler montert fra denne tubulinen kan brukes i rekonstitueringsanalyser basert på den totale interne refleksjonsfluorescensen (TIRF) mikroskopiteknikk med enten dynamiske eller stabile mikrotubuler, i eksperimenter som tester mikrotubuldynamikk, interaksjoner med MAPer eller molekylære motorer, og kraftgenerering av…

Discussion

Metoden som er beskrevet her, gir en plattform for raskt å generere monterings kompetent tubulin av høy kvalitet i mellomstore mengder fra cellelinjer og enkeltmushjerner. Den er basert på gullstandardprotokollen for tubulinrensing fra storfehjerner som brukes i feltet i mange år^16,17. En spesiell fordel med tilnærmingen er bruken av suspensjonskulturer av HeLa S3-celler, som når de er etablert, gir store mengder celler samtidig som det krever lite praktisk…

Materials

1 M MgCl2	Sigma	#M1028
1-L cell culture vessels	Techne F7610		Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol	Sigma	#M3148	2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride	Sigma	#A8456
40% Acrylamide	Bio-Rad	#161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)	Sigma	#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10	Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa		dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	dilution: 1/20,000
Aprotinin	Sigma	#A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles			For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge			For collecting spinner cultures
Biological stirrer	Techne MCS-104L		Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide	Bio-Rad	#161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®			For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
Bromophenol blue	Sigma	#1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium	Life Technologies	#41965062
DTT, DL-Dithiothreitol	Sigma	#D9779
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma	#E3889
Ethanol absolute	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F7524
French pressure cell press	Thermo electron corporation	#FA-078A	with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol	VWR Chemicals	#24388.295
Glycine	Sigma	#G8898
GTP	Sigma	#G8877
Heating block	Stuart	#SBH130D
Hela cells		ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells	ATCC	ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )	VWR	#20252.290
Inverted microscope			With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
JLA-8.1000 rotor			For collecting spinner cultures
KOH	Sigma	#P1767	KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine	Life Technologies	#25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes	Sigma	4-16 K
Leupeptin	Sigma	#L2884
Liquid nitrogen
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles	Eppendorf	#0030 120.973
Mouse brain tissue			Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm	Terumo	#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm	Terumo	#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Life Technologies	#14190169
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	#P7626	PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES	Sigma	#P6757
Pipette-boy
Rotors	Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment	Bio-Rad	#1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate	VWR	#442444H	For preparing Laemmeli buffer
SDS, Sodium dodecyl sulphate	Sigma	#L5750	For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator	Branson	#101-148-070	Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma	#9281
Trichostatin A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma	#T9284
Trizma base (Tris)	Sigma	#T1503
Trypsin	Life Technologies	#15090046
Ultracentrifuge rotors		TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#357448	for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#349622	for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#355631	for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges	Beckman	Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders			Set at 30°C