Rening av tubulin med kontrollerade posttranslational modifieringar och isotyper från begränsade källor genom polymerisation-depolymeriseringscykler

Summary

Detta protokoll beskriver tubulin rening från små /medelstora källor såsom odlade celler eller enstaka mus hjärnor, med hjälp av polymerisation och depolymerisering cykler. Det renade tubulinet är berikat i specifika isotyper eller har specifika posttranslational modifieringar och kan användas i in vitro-beredningsanalyser för att studera mikrotubuledynamik och interaktioner.

Abstract

En viktig aspekt av studier av microtubule cytoskeleton är undersökningen av microtubule beteende i in vitro rekonstitution experiment. De möjliggör analys av de inneboende egenskaperna hos mikrotubuler, såsom dynamik, och deras interaktioner med mikrotubule-associerade proteiner (MAPs). “Tubulinkoden” är ett framväxande koncept som pekar på olika tubulinisottyper och olika posttranslational modifieringar (PTMs) som regulatorer av mikrotubule egenskaper och funktioner. För att utforska de molekylära mekanismerna i tubulinkoden är det viktigt att utföra in vitro-rekonstitutionsexperiment med renad tubulin med specifika isotyper och PTMs.

Hittills var detta tekniskt utmanande som hjärnan tubulin, som används ofta i in vitro experiment, hyser många PTMs och har en definierad isotyp sammansättning. Därför utvecklade vi detta protokoll för att rena tubulin från olika källor och med olika isotypkompositioner och kontrollerade PTMs, med hjälp av den klassiska metoden för polymerisation och depolymerisering cykler. Jämfört med befintliga metoder baserade på affinitet rening, ger detta tillvägagångssätt ren, polymerisation-kompetent tubulin, som tubulin resistent mot polymerisation eller depolymerisering kasseras under de successiva rening steg.

Vi beskriver reningen av tubulin från cellinjer, odlas antingen i suspension eller som vidhäftande kulturer, och från enstaka mus hjärnor. Metoden beskriver först genereringen av cellmassa i både suspension och vidhäftande inställningar, lyssteget, följt av de successiva stadierna av tubulinrening genom polymerisation-depolymeriseringscykler. Vår metod ger tubulin som kan användas i experiment som behandlar effekten av tubulinkoden på de inneboende egenskaperna hos mikrotubuler och mikrotubuleinteraktioner med associerade proteiner.

Introduction

Mikrotubuler spelar kritiska roller i många cellulära processer. De ger cellerna sin form, bygger meiotiska och mitotiska spindlar för kromosomsegregering och fungerar som spår för intracellulär transport. För att utföra dessa olika funktioner organiserar sig mikrotubuler på olika sätt. En av de spännande frågorna inom området är att förstå de molekylära mekanismer som gör det möjligt för de strukturellt och evolutionärt bevarade mikrotubulerna att anpassa sig till denna mängd organisationer och funktioner. En potentiell mekanism är diversifiering av mikrotubuli, som definieras av begreppet “tubulinkod”^1,2,3. Tubulinkoden innehåller två huvudkomponenter: differentiell inkorporering av genprodukterna α- och β-tubulin (tubulinisotyper) i mikrotubuli och tubulin posttranslational modifieringar (PTMs).

Sedan 1970-talet har in vitro-rekonstitutionsexperiment, i kombination med framväxande ljusmikroskopitekniker, banat väg för viktiga upptäckter om egenskaperna hos mikrotubuler: dynamisk instabilitet⁴ och löpband⁵, och deras andra mekanismer och^{funktioner 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Nästan alla in vitro-experiment som utförts hittills har baserats på tubulin renat från hjärnvävnad med upprepade cykler av polymerisation och depolymerisering^16,17. Även om rening från hjärnvävnaden ger fördelen av att få högkvalitativ tubulin i stora mängder (vanligtvis gram mängder), är en viktig nackdel heterogeniteten som tubulin renad från hjärnvävnad är en blandning av olika tubulin isotyper och berikas med många tubulin PTMs. Denna heterogenitet gör det omöjligt att avgränsa rollen för en viss tubulin PTM eller isotyp i kontrollen av mikrotubule egenskaper och funktioner. Att producera monteringskompande tubulin med kontrollerade tubulin-PTM:er och homogen isotypsammansättning är därför viktigt för att ta itu med tubulinkodens molekylära mekanismer.

Nyligen har en metod för att rena tubulin genom affinitetskromatografi med hjälp av den mikrotubulebindande TOG-domänen (tumör-överuttryckt gen) av jäst Stu2p utvecklats¹⁸. I denna metod passerar tubulin i rålystnater av celler eller vävnad genom en kolumn där den binder till den matris-immobiliserade TOG-domänen, vilket möjliggör analys av hela tubulinpoolen i ett givet, till och med mycket litet, prov. Ett efterlängtat tillvägagångssätt för att rena rekombinant tubulin har också beskrivits under de senaste åren. Det är baserat på baculovirussystemet, där en bi-cistronic vektor som innehåller α- och β-tubulingener uttrycks i insektsceller¹⁹. Denna metod är dock mycket besvärlig och tidskrävande och används därför främst för att studera effekten av tubulinmutationer²⁰ och tubulinisotyper^21,22,23 in vitro.

I det nuvarande protokollet beskriver vi en metod som använder den väletablerade och allmänt använda polymerisationsdepolymeriseringsmetoden som en plan för att generera tubulin med olika nivåer av modifiering antingen från cellinjer eller från mushjärnvävnad²⁴. I detta förfarande cyklas tubulin mellan lösliga (tubulin dimer vid 4 °C) och polymeriserad form (mikrotubule vid 30 °C i närvaro av guanosin 5′-triphosphate [GTP]). Varje form separeras genom successiva centrifugeringssteg: tubulin dimers kommer att förbli i supernatanten efter en kall (4 °C) spinn, medan mikrotubuler kommer att pelleteras vid 30 °C. Dessutom utförs ett polymerisationssteg vid hög piperazin-N,N′-bis(2-etanesulfonsyra) (PIPES) koncentration, vilket gör det möjligt att avlägsna mikrotubule-associerade proteiner från mikrotubulerna och därmed från det slutligen renade tubulinet. Tubulin renad från HeLa S3-celler som odlas som suspension eller vidhäftande kulturer är praktiskt taget fri från någon tubulin PTM och har använts i de senaste in vitro-rekonstitutionsexperimenten^25,26,27,28. Vi har ytterligare anpassat metoden för att rena tubulin från enmushjärnor, som kan användas för ett stort antal musmodeller med förändringar i tubulinisottyper och PTM.

I protokollet beskriver vi först genereringen av källmaterialet (cellmassa eller hjärnvävnad), dess lysis (Figur 1A), följt av successiva steg av tubulinpolymerisering och depolymerisering för att rena tubulinet (Figur 1B). Vi beskriver vidare processen för att bedöma renheten (figur 2A, B) och kvantiteten ( figur3A, B) av det renade tubulinet. Metoden kan anpassas för att producera tubulin berikat med en utvald PTM genom att överuttrycka ett modifierande enzym i celler före tubulinrening (Figur 4B). Alternativt kan tubulinmodifierande enzymer tillsättas till tubulin under reningsprocessen. Slutligen kan vi rena tubulin som saknar specifika isotyper eller PTM från hjärnan hos möss som saknar motsvarande tubulinmodifierande enzymer (Figur 4B)²⁹.

Metoden vi beskriver här har två huvudsakliga fördelar: i) det möjliggör produktion av tillräckligt stora mängder tubulin på relativt kort tid, och (ii) det genererar högkvalitativ, ren tubulin, med antingen specifik tubulin isotypkomposition eller PTMs. I den tillhörande videon av detta manuskript belyser vi några av de kritiska stegen som är involverade i denna procedur.

Protocol

Djurvård och användning för denna studie utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapens rekommendationer (2010/63/UE). Experimentella förfaranden godkändes särskilt av den etiska kommittén vid Institut Curie CEEA-IC #118 (tillstånd nr 04395.03 från den nationella myndigheten) i enlighet med de internationella riktlinjerna. 1. Beredning av reagenser för tubulinrening OBS: Alla buffertar som används för tubulinrening bör innehålla kaliumsalter och INTE n…

Representative Results

Huvudsyftet med denna metod är att producera högkvalitativ, monteringsbekräftande tubulin i mängder som är tillräckliga för att utföra upprepade in vitro-experiment med de renade komponenterna. Mikrotubuli monterade från detta tubulin kan användas i beredningsanalyser baserade på tirf-mikroskopiteknik (Total Internal Reflection Fluorescence) med antingen dynamiska eller stabila mikrotubuler, i experiment som testar mikrotubuledynamik, interaktioner med MAPs eller molekylära motorer och kraftgenerering<sup cla…

Discussion

Metoden som beskrivs här ger en plattform för att snabbt generera högkvalitativ, monterings kompetent tubulin i medelstora stora mängder från cellinjer och enmushjärnor. Det är baserat på guldstandardprotokollet för tubulinrening från nötkreatur hjärnor som används på fältet i många år^16,17. En särskild fördel med tillvägagångssättet är användningen av suspensionskulturer av HeLa S3-celler, som när de väl har etablerats ger stora mängde…

Materials

1 M MgCl2	Sigma	#M1028
1-L cell culture vessels	Techne F7610		Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol	Sigma	#M3148	2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride	Sigma	#A8456
40% Acrylamide	Bio-Rad	#161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)	Sigma	#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10	Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa		dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	dilution: 1/20,000
Aprotinin	Sigma	#A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles			For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge			For collecting spinner cultures
Biological stirrer	Techne MCS-104L		Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide	Bio-Rad	#161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®			For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
Bromophenol blue	Sigma	#1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium	Life Technologies	#41965062
DTT, DL-Dithiothreitol	Sigma	#D9779
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma	#E3889
Ethanol absolute	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F7524
French pressure cell press	Thermo electron corporation	#FA-078A	with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol	VWR Chemicals	#24388.295
Glycine	Sigma	#G8898
GTP	Sigma	#G8877
Heating block	Stuart	#SBH130D
Hela cells		ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells	ATCC	ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )	VWR	#20252.290
Inverted microscope			With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
JLA-8.1000 rotor			For collecting spinner cultures
KOH	Sigma	#P1767	KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine	Life Technologies	#25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes	Sigma	4-16 K
Leupeptin	Sigma	#L2884
Liquid nitrogen
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles	Eppendorf	#0030 120.973
Mouse brain tissue			Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm	Terumo	#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm	Terumo	#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Life Technologies	#14190169
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	#P7626	PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES	Sigma	#P6757
Pipette-boy
Rotors	Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment	Bio-Rad	#1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate	VWR	#442444H	For preparing Laemmeli buffer
SDS, Sodium dodecyl sulphate	Sigma	#L5750	For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator	Branson	#101-148-070	Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma	#9281
Trichostatin A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma	#T9284
Trizma base (Tris)	Sigma	#T1503
Trypsin	Life Technologies	#15090046
Ultracentrifuge rotors		TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#357448	for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#349622	for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#355631	for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges	Beckman	Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders			Set at 30°C