Denne protokollen beskriver tubulinrensing fra små/mellomstore kilder som dyrkede celler eller enkeltmushjerner, ved hjelp av polymerisasjons- og depolymeriseringssykluser. Den rensede tubulinen er beriket i spesifikke isotyper eller har spesifikke posttranslasjonelle modifikasjoner og kan brukes i in vitro rekonstitueringsanalyser for å studere mikrotubuldynamikk og interaksjoner.
Et viktig aspekt ved studier av mikrotubul cytoskeleton er undersøkelse av mikrotubul atferd i in vitro rekonstitueringseksperimenter. De tillater analyse av de iboende egenskapene til mikrotubuler, som dynamikk, og deres interaksjoner med mikrotubule-assosierte proteiner (MAPer). “Tubulin-koden” er et fremvoksende konsept som peker på forskjellige tubulinisotyper og ulike posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMer) som regulatorer av mikrotubule egenskaper og funksjoner. For å utforske de molekylære mekanismene i tubulinkoden, er det avgjørende å utføre in vitro rekonstitueringsforsøk ved hjelp av renset tubulin med spesifikke isotyper og PTMer.
Til dags dato var dette teknisk utfordrende som hjerne tubulin, som er mye brukt i in vitro eksperimenter, havner mange PTMer og har en definert isotype sammensetning. Derfor utviklet vi denne protokollen for å rense tubulin fra forskjellige kilder og med forskjellige isotypesammensetninger og kontrollerte PTMer, ved hjelp av den klassiske tilnærmingen til polymerisasjon og depolymeriseringssykluser. Sammenlignet med eksisterende metoder basert på affinitetsrensing, gir denne tilnærmingen ren, polymerisasjons-kompetent tubulin, da tubulinresistent mot polymerisering eller depolymerisering kastes under de påfølgende rensetrinnene.
Vi beskriver rensing av tubulin fra cellelinjer, vokst enten i suspensjon eller som tilhengerkulturer, og fra enkeltmushjerner. Metoden beskriver først genereringen av cellemasse i både suspensjons- og tilhengerinnstillinger, lysistrinnet, etterfulgt av de påfølgende stadiene av tubulinrensing ved polymeriseringsdepolymeriseringssykluser. Vår metode gir tubulin som kan brukes i eksperimenter som adresserer virkningen av tubulinkoden på de iboende egenskapene til mikrotubuler og mikrotubulinteraksjoner med tilknyttede proteiner.
Mikrotubuler spiller kritiske roller i mange cellulære prosesser. De gir cellene sin form, bygger meiotiske og mitotiske spindler for kromosomsegregering, og tjener som spor for intracellulær transport. For å utføre disse forskjellige funksjonene organiserer mikrotubuler seg på forskjellige måter. Et av de spennende spørsmålene på feltet er å forstå de molekylære mekanismene som gjør at de strukturelt og evolusjonært bevarte mikrotubulene kan tilpasse seg denne mengden organisasjoner og funksjoner. En potensiell mekanisme er diversifisering av mikrotubuler, som er definert av konseptet kjent som ‘tubulinkoden’1,2,3. Tubulinkoden inneholder to hovedkomponenter: differensialinkorporering av α- og β-tubulingenprodukter (tubulinisotyper) i mikrotubulene og tubulin posttranslational modifikasjoner (PTMer).
Siden 1970-tallet har in vitro rekonstitueringsforsøk, kombinert med utviklende lysmikroskopiteknikker, banet vei for viktige funn om egenskapene til mikrotubuler: dynamisk ustabilitet4 og tredemølle5, og deres andre mekanismer og funksjoner6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Nesten alle in vitro-forsøkene som er utført så langt, har vært basert på tubulin renset fra hjernevev ved hjelp av gjentatte sykluser av polymerisering og depolymerisering16,17. Selv om rensing fra hjernevevet gir fordelen av å skaffe høykvalitets tubulin i store mengder (vanligvis grammengder), er en viktig ulempe heterogeniteten som tubulin renset fra hjernevev er en blanding av forskjellige tubulin isotyper og er beriket med mange tubulin PTMs. Denne heterogeniteten gjør det umulig å avgrense rollen til en bestemt tubulin PTM eller isotype i kontroll av mikrotubule egenskaper og funksjoner. Dermed er det viktig å produsere monterings kompetent tubulin med kontrollerte tubulin PTMer og homogen isotypesammensetning for å adressere molekylmekanismene til tubulinkoden.
Nylig har en tilnærming for å rense tubulin ved affinitetskromatografi ved hjelp av det mikrotubule-bindende TOG -domenet (tumor-overekspressert gen) av gjær Stu2p blitt utviklet18. I denne metoden overføres tubulin i rå lysater av celler eller vev gjennom en kolonne der den binder seg til det matrise-immobiliserte TOG-domenet, noe som gjør det mulig å analysere hele tubulinbassenget til en gitt, til og med veldig liten prøve. En etterlengtet tilnærming for å rense rekombinant tubulin har også blitt beskrevet de siste årene. Den er basert på baculovirussystemet, der en bi-cistronic vektor som inneholder α- og β-tubulingener uttrykkes i insektceller19. Denne metoden er imidlertid veldig tungvint og tidkrevende og brukes derfor mest til å studere effekten av tubulinmutasjoner20 og tubulin isotyper21,22,23 in vitro.
I den nåværende protokollen beskriver vi en metode som bruker den veletablerte og mye brukte polymerisasjonsdepolymeriseringsmetoden som en blåkopi for å generere tubulin med forskjellige nivåer av modifikasjon enten fra cellelinjer eller fra musens hjernevev24. I denne prosedyren sykles tubulin mellom den oppløselige (tubulin dimer ved 4 °C) og polymerisert form (mikrotubul ved 30 °C i nærvær av guanosin 5′-tripfosfat [GTP]). Hver form er skilt gjennom påfølgende trinn i sentrifugering: tubulin dimers vil forbli i supernatanten etter et kaldt (4 °C) spinn, mens mikrotubuler vil bli pelletert ved 30 °C. Videre utføres ett polymerisasjonstrinn ved høy piperazin-N,N′-bis(2-etesulfonsyre) (PIPES) konsentrasjon, noe som gjør det mulig å fjerne mikrotubule-assosierte proteiner fra mikrotubulene og dermed fra den endelig rensede tubulin. Tubulin renset fra HeLa S3 celler vokst som suspensjon eller tilhenger kulturer er nesten fri for noen tubulin PTM og har blitt brukt i nyere in vitro rekonstituering eksperimenter25,26,27,28. Vi har videre tilpasset metoden for å rense tubulin fra enkeltmushjerner, som kan brukes til et stort antall musemodeller med endringer i tubulinistyper og PTMer.
I protokollen beskriver vi først genereringen av kildematerialet (cellemasse eller hjernevev), dets lysis (figur 1A), etterfulgt av de påfølgende trinnene for tubulinpolymerisering og depolymerisering for å rense tubulinen (figur 1B). Vi beskriver videre prosessen for å vurdere renheten (figur 2A, B) og mengden ( figur3A,B) av den rensede tubulinen. Metoden kan tilpasses for å produsere tubulin beriket med en valgt PTM ved å overtrykke et modifiserende enzym i celler før tubulinrensing (figur 4B). Alternativt kan tubulinmodifiserende enzymer legges til tubulin under renseprosessen. Til slutt kan vi rense tubulin som mangler spesifikke isotyper eller PTMer fra hjernen til mus som mangler i de tilsvarende tubulinmodifiserende enzymene (Figur 4B)29.
Metoden vi beskriver her har to hovedfordeler: (i) det tillater produksjon av tilstrekkelig store mengder tubulin på relativt kort tid, og (ii) det genererer ren tubulin av høy kvalitet, med enten spesifikk tubulin isotypesammensetning eller PTMer. I den tilknyttede videoen av dette manuskriptet fremhever vi noen av de kritiske trinnene som er involvert i denne prosedyren.
Metoden som er beskrevet her, gir en plattform for raskt å generere monterings kompetent tubulin av høy kvalitet i mellomstore mengder fra cellelinjer og enkeltmushjerner. Den er basert på gullstandardprotokollen for tubulinrensing fra storfehjerner som brukes i feltet i mange år16,17. En spesiell fordel med tilnærmingen er bruken av suspensjonskulturer av HeLa S3-celler, som når de er etablert, gir store mengder celler samtidig som det krever lite praktisk…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 og Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ støttes av Institut Curie, Det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) tildeler ANR-12-BSV2-0007 og ANR-17-CE13-0021, Institut National du Cancer (INCA) stipend 2014-PL BIO-11-ICR-1, og Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) tilskudd DEQ201703676. MMM støttes av Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p, og av France Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. JAS ble støttet av EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen No 675737, og FRM-bevilgningen FDT201904008210. SB ble støttet av FRM grant FDT201805005465.
Vi takker alle medlemmer av Janke lab, spesielt J. Souphron, samt G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) og A. Gautreau (Ecole Polytechnique) for hjelp under etableringen av protokollen. Vi vil gjerne takke dyreavdelingen til Institut Curie for hjelp med musavl og omsorg.
Antistoffet 12G10, utviklet av J. Frankel og M. Nelson, ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdt av University of Iowa.
1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
1.5- and 2-ml tubes | |||
14-ml round-bottom tubes | |||
15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
15-ml screw-cap tubes | |||
2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
5-, 10- 20-ml syringes | |||
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
50-ml screw-cap tubes | |||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
Balance (0.1 – 10 g) | |||
Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
Cell culture hood | |||
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
EGTA | Sigma | #E3889 | |
Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
Glycine | Sigma | #G8898 | |
GTP | Sigma | #G8877 | |
Heating block | Stuart | #SBH130D | |
Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
jetPEI | Polyplus | #101 | |
JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
Liquid nitrogen | |||
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
Parafilm | |||
PBS | Life Technologies | #14190169 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
pH-meter | |||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
PIPES | Sigma | #P6757 | |
Pipette-boy | |||
Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
Vortex mixer | |||
Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |