Summary
Här beskriver vi RatWalker-systemet, byggt genom att omforma MouseWalker-apparaten för att tillgodose den ökade storleken och vikten hos råttor. Detta system använder frustrerad total intern reflektion (FTIR), höghastighetsvideoinspelning och analysprogramvara med öppen åtkomst för att spåra och kvantifiera gångparametrar.
Abstract
Parkinsons sjukdom (PD) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som orsakas av förlusten av dopaminerga (DA) neuroner i substantia nigra pars compacta. Gångavvikelser, inklusive minskad armsvängning, långsammare gånghastighet och kortare steg är vanliga hos PD-patienter och uppträder tidigt i sjukdomsförloppet. Således kommer kvantifieringen av motoriska mönster i djurmodeller av PD att vara viktig för fenotypisk karakterisering under sjukdomsförloppet och vid terapeutisk behandling. De flesta fall av PD är idiopatiska; Identifieringen av ärftliga former av PD avslöjade dock genmutationer och varianter, såsom funktionsförlustmutationer i Pink1 och Parkin, två proteiner involverade i mitokondriell kvalitetskontroll som kunde utnyttjas för att skapa djurmodeller. Medan möss är resistenta mot neurodegeneration vid förlust av Pink1 och Parkin (enkel och kombinerad deletion), hos råttor, leder Pink1 men inte Parkin-brist till nigral DA-neuronförlust och motorisk försämring. Här rapporterar vi nyttan av FTIR-avbildning för att avslöja gångförändringar hos fritt gående unga (2 månaders ålder) hanråttor med kombinerad förlust av Pink1 och Parkin före utvecklingen av grov visuellt uppenbar motorisk abnormitet när dessa råttor åldras (observerade vid 4-6 månader), kännetecknad av bakbenssläpning som tidigare rapporterats hos Pink1 knockout (KO) råttor.
Introduction
PD, den vanligaste åldersrelaterade neurodegenerativa rörelsestörningen, orsakas av förlusten av DA-neuroner i substantia nigra pars compacta. Denna förlust av nigrala DA-neuroner och DA-ingångarna i striatum leder till de observerade motoriska funktionsnedsättningarna som ses hos patienter med PD 1,2. De definierande motoriska egenskaperna hos patienter med PD, gemensamt kända som Parkinsonism, inkluderar styvhet, vilande tremor, bradykinesi, postural instabilitet och mikrografi3. Dessutom uppträder gångrubbningar, som är vanliga hos PD-patienter, tidigt i sjukdomsförloppet 1,4,5. Medan vissa livsstilar föreslås för att hjälpa till att bromsa utvecklingen av PD, såsom hälsosam kost och regelbunden motion, finns det för närvarande inget botemedel mot PD, bara mediciner för att hantera symtomen. Detta lämnar utrymme för behovet av ytterligare undersökning i hopp om förbättrad terapi. Således är karakterisering av gångmönstret i PD-djurmodeller ett avgörande verktyg för att karakterisera modellens relevans samt hur terapeutiska behandlingar som syftar till att kontrollera PD förebygger eller förbättrar motoriska funktionsnedsättningar.
Det finns olika PD-djurmodeller som har använts för att testa terapeutiska behandlingar, men var och en har sina begränsningar. Till exempel har djurmodeller behandlade med neurotoxinet 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) gett en stor mängd information om processer som är viktiga för nigral DA-neuronförlust och efterföljande striatala anpassningar och pekade på mitokondriernas roll i PD-patogenes; MPTP-modellens patogenetiska bakgrund är dock av toxisk natur snarare än en neurodegenerativ process som i human PD6. Ytterligare kemiskt inducerbara modeller inkluderar 6-hydroxidopamin (6-OHDA) och rotenon. 6-OHDA var det första medlet som användes för att inducera PD genom selektiv ackumulering av läkemedlet i DA-neuronerna, vilket så småningom dödar neuronerna och leder till PD-liknande symtom. Denna modell användes först för att spåra DA-utarmning genom att undersöka beteendet som svar på amfetamin och apomorfin7. Denna metod för PD-induktion har visat sig vara användbar för screening av farmakologiska medel som påverkar DA och dess receptorer8. Medan 6-OHDA-modellen är en bra modell för att spåra kvantifierbara motorunderskott, visar denna modell inte hur den gradvisa förlusten av neuroner och bildandet av Lewy-kroppar påverkar djuret. Den andra metoden för induktion, rotenon, har visat sig ha progressiv degeneration av nigrostriatala neuroner med förlust av tyrosinhydroxylas och DA-transportör, vilket möjliggör en bättre modell för att spåra förlust av neuroner över tid9. De rotenonbehandlade råttorna visade bradykinesi, postural instabilitet och ostadig gång10. Denna metod har dock visat sig vara mycket varierande mellan olika stammar av råttor, vilket har väckt frågan om rotenon är en pålitlig PD-modell11,12,13. Medan gånganalys har visat sig påverkas av induktion av PD hos råttor, har genetiskt inducerade PD-råttmodeller hittills inte lätt använts för gånganalys genom att fritt gå ner på en landningsbana.
Ett sätt att analysera motorisk nedsättning hos fritt gående gnagare är kinematisk gånganalys, som kan utföras genom att använda FTIR-avbildning. Denna etablerade metod använder en optisk beröringssensor baserad på FTIR, som registrerar och spårar gnagarnas fotavtryck när de rör sig nerför banan14,15,16. Jämfört med andra metoder är FTIR inte beroende av några markörer på djurets kropp som kan störa tassavtrycken. Generering av videodata ger digitala tassavtryck av alla fyra extremiteterna som kan kombineras för att skapa ett dynamiskt och reproducerbart gångmönster för olika gnagarmodeller. Principen för avbildningsbaserad gånganalys är att ta varje enskild tass och mäta kontaktytan över tid när gnagaren går nerför banan. Varje hållning representeras av en ökning av tassområdet (i bromsfasen) och en minskning av tassområdet (i framdrivningsfasen). Detta fortsätter med svängfasen, vilket är när det inte detekteras någon tasssignal. Efter utvärdering av videon genereras flera parametrar som kan användas för att jämföra vildtyp (WT) kontra PD-modell. Några exempel på parametrarna är steglängd (avstånd tassen täcker i ett steg), svängtid (varaktighet som tassen inte är i kontakt med banan), svänghastighet (steglängd som en funktion av svängvaraktighet) och stegmönster (diagonala steg, sidosteg eller gördelsteg).
För att demonstrera nyttan av FTIR för att avslöja tidiga gångmönsterförändringar hos råttor använde vi en genetisk råttmodell av PD. Medan de flesta fall av PD är idiopatiska; identifieringen av ärftliga former av PD avslöjade genmutationer och varianter, såsom funktionsförlustmutationer i Pink1 och Parkin, två proteiner involverade i mitokondriell kvalitetskontroll17, som kunde utnyttjas för att skapa djurmodeller18. Tyvärr är möss resistenta mot neurodegeneration vid förlust av dessa proteiner (enstaka och kombinerade)19,20,21. Hos råttor leder Pink1 men inte Parkin-brist till nigral DA-neuronförlust och motoriska funktionsnedsättningar22, men utan fullständig penetrans. Därför genererade vi en kombinerad Pink1 / Parkin dubbel knockout (DKO) råttmodell, som visar den uppenbara visuellt uppenbara bakbensdragande fenotypen som rapporterats hos manliga Pink1 KO-råttor22 men nu i högre takt: 100% mot 30-50% av hanarna mellan 4-6 månader.
Medan denna metod fungerar bra för att analysera motorunderskott hos möss14, var FTIR-bildgångsystemspecifikationer för att rymma råttans storlek och vikt tidigare inte tillgängliga icke-kommersiellt. Här förklarar vi hur man bygger RatWalker, ett modifierat FTIR gångbildningssystem modellerat efter MouseWalker14, förutom anpassat för råttornas storlek och vikt. Detta system använder en optisk effekt, FTIR, för att tillhandahålla en metod för att visualisera och därefter registrera djuravtryck för analys. Kontakt mellan ett djurs fot och den optiska vågledaren (plattformen) orsakar störningar i ljusvägen vilket resulterar i en synlig spridningseffekt, som fångas med hjälp av inhemsk kvalitet, höghastighetsvideografi och bearbetning med öppen källkod. Denna studie visar kraften i FTIR-avbildning för att studera gångförändringar i genetiska råttmodeller av PD. Till exempel, medan uppenbara visuellt uppenbara motoriska förändringar (dvs. bakbenssläpning) observeras hos manliga DKO-råttor tidigast vid 4 månader, kan vi med hjälp av FTIR avslöja grindavvikelser hos manliga DKO-råttor vid 2 månaders ålder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier godkändes av University of Nebraska Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Gångapparat
OBS: Modellerad från MouseWalker14, RatWalker designades med dimensioner i proportion till skillnaden i steglängd mellan råttor och möss. Den består av bakgrundsbelysning för sidobelysning, gångväg, optisk vågledargång, spegel och kamera (figur S1). LED-remsor, orienterade i förskjuten position, användes på vardera sidan av gångvägen och bakgrundsbelysningsvågledarna för att rymma det extra materialet. De material som behövs för att bygga den modifierade gångapparaten finns i tabell S1.
- Använd en bakgrundsbelysning (figur S2) för att skapa en silhuett av djuret som används av programvaran för att tilldela position, rörelseriktning och morfometriska egenskaper. Konstruktionen består av en skiktad panel av en akryldiffusor, optisk vågledare, reflektor och LED-ljusremsor monterade i en aluminiumram (tabell S1).
- Använd en gångbrygga (figur S3) för att leda djuret längs plattformen och rikta djuret till hemburen. Konstruktionen består av klara akrylskivor lösningsmedel svetsade med diklormetan (tabell S2).
- Använd gångbryggan (figur S4) för att tillhandahålla mediet för att generera upplysta fotavtryck. Gångbryggan är konstruerad av klar akryl, som är sidobelyst med bandlysdioder och inrymd i aluminiumvinkel (tabell S3).
- Placera en spegel (figur S5) direkt under gångbanan i 45 graders vinkel för att reflektera undersidan av gångbanan för videografi. Den är konstruerad av en 1/4 "tjock glasspegel som stöds av akryl och vinklade fästen arrangerade i rad (tabell S4).
- Utför videografi med hjälp av en stativmonterad, höghastighets actionkamera av inhemsk kvalitet.
2. Installation av utrustning
- Rikta in bakgrundsbelysningen, gångvägen och spegeln enligt figur S1, ovanpå en bänkskiva, arbetsbänk eller stabil vagn. Se till att varje komponent är centrerad i förhållande till gångbanan.
- Använd en nivå, se till att komponenterna är horisontellt lod.
- Placera gångbryggans hölje ovanpå gångvägen.
- Rengör alla kontaktytor med 70% etanol. Se till att använda en icke-slipande handduk för att förhindra repor på gångvägen.
- Montera höghastighetskameran på ett 57-tums stativ och placera det mittlinjen mot spegeln, tillräckligt långt för att fånga hela gångvägen inuti synfältet. Från videoinställningsmenyn ser du till att höghastighetskameran är inställd på linjär insamling i 1080p-läge med 120 bilder per sekund (fps) med alla typer av autojustering eller optimeringar avstängda.
- Anslut och slå på LED-lamporna för bakgrundsbelysning och gångväg. Det kan vara nödvändigt att dämpa bakgrundsbelysningen för att minska bakgrundsinspelningen.
3. Acklimatisering av djur
OBS: En vecka före det första försöket körs djuren genom den modifierade gångapparaten.
- Placera en hembur vid gångbanans ändhåll.
- Med höljet installerat och lamporna släckta, placera råttan i slutet av gångvägen mittemot hemburen och låt den gå över gångvägen på ett otvunget sätt.
- Kör varje råtta genom den modifierade gångapparaten flera gånger tills de smidigt kan korsa hela gångvägen.
- Upprepa processen två dagar före experimentet.
4. Gångförfarande
- Placera en hembur i slutet av gångvägen före början av varje körning för att fungera som en positiv signal för råttan att korsa gångvägen.
- Stäng av rumsbelysningen, slå på kameran och börja spela in flera sekunder innan råttan placeras på plattformen.
OBS: Var noga med att använda ett minneskort som officiellt rekommenderas av kameratillverkaren. Ett onoterat minneskort kan fortfarande fungera men är inte garanterat att fånga med den påstådda bildhastigheten. - Med höljet installerat, placera råttan i slutet av gångvägen mittemot hemburen och låt den gå över gångvägen på ett otvunget sätt.
- Sluta spela in när djuret når gångvägens slutstation.
- Rengör gångvägen med 70% etanol och en icke-slipande handduk mellan körningar och efter att ett djur urinerar eller defekerar, låt sedan etanol avdunsta innan du introducerar ett annat djur.
- Kör råttorna genom gångvägen totalt 7 gånger under varje observationsperiod, ta de tre första körningarna som poäng som passerar för analys.
- Gör en körning som godkänd om djuret gör fyra eller fler på varandra följande steg i riktning mot hemburen utan avbrott på grund av grooming, paus eller felaktiga rörelser.
OBS: Det är god praxis att registrera djurens massa före varje åtgärdsomgång. För vår studie vägde WT (n = 7) och DKO (n = 8) 200,3 ± 21,67 g respektive 296,6 ± 3,85 g (p = 0,004, oparat t-test med Welchs korrigering). Vi ser inget problem med råttor i alla åldrar eller storlekar.
5. Förbehandling av video
OBS: Videorna som tagits av höghastighetskameran återges i mp4-format vid 120 fps och en upplösning på 1080p. För att underlätta bördan på analysprogramvaran nedströms, trimma först onödiga bilder och ta bort ljudet från varje video med LosslessCut-programvaran (version 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), konvertera sedan mp4-videoströmmen till en png-bildsekvens med öppen källkodsprogramvara FFmpeg (version 4.2, http://ffmpeg.org/). Obs: andra förlustfria format som tiff kan användas i stället för png.
- Skapa en katalog för videorna på en dator med Windows 7 eller senare och överför sedan videoklippen från höghastighetskamerans lagringsenhet till den nya katalogen. Dessutom kopierar du ffmpeg.exe till samma plats.
- I LosslessCut drar du videorna till gränssnittet för att öppna. Ignorera ljudet, ställ in start- och slutklipppunkterna så att de endast inkluderar den analytiskt relevanta delen av videon, ställ in bildruteformatet på png och exportera. När videon har exporterats byter du namn på videofilen med valfri namngivningskonvention följt av "_trimmed".
- För att batchkonvertera videorna till bildsekvenser, öppna en kommandotolk, ställ in arbetskatalogen till platsen för videorna med "cd [sökväg till katalog]" och kör följande kommandon:
för %i in (*) do mkdir "%~ni_cropped"
för %i in (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
för /f "tokens=1 delims=." %a i ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png" - När batchprocessen är klar öppnar du varje bildsekvens i ImageJ Fiji23 och beskär sekvensen till området av intresse (ROI) som omfattar det område på golvet inom vilket råttan observeras.
- Om du vill minska bakgrunden från gångbanans belysning ökar du cyankanalens färgbalans till minst 76.
- Spara som bildsekvens och ändra suffixet "_trimmed" till "_cropped" och spara filerna i respektive "_cropped" -mapp.
6. Gångbearbetning
Gångdata bearbetas och kvantifieras med hjälp av den fritt tillgängliga programvaran, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.
- Packa upp och installera MouseWalker-programvaran på en dator som kör en 64-bitars Windows-miljö med Microsoft Excel installerat.
- När du har startat MouseWalker.exe utför du en inledande skalkalibrering för varje uppsättning körningar. Ladda en bildsekvens och använd landmärken eller en linjal som tagits i videon, mäta två punkter med känt avstånd. Beräkna antalet pixlar per centimeter i videoramen och ange detta värde i parameteravsnittet i inställningsformuläret tillsammans med bildhastigheten för videoförvärv.
- På samma sätt mäter du råttans huvud, svans och fötter för att bestämma huvudlängd, maximal svansbredd och yta, minsta och maximala fotyta och andra funktioner som är nödvändiga för att slutföra avsnittet om spårningsparametrar i inställningsformuläret för MouseWalker. Se http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ för användarhandboken och annan dokumentation.
- Om du vill hämta värdena för kroppsytan öppnar du samma bildsekvens i ImageJ, ritar en markering som beskriver råttan och utför ett pixelantal för intresseområden (ROI).
- Parametrar och inställningar som används för denna publikation (figur S6).
Parametrar tillhandahålls för illustration och beror på videons skala, förvärvsmaskinvara och förhållanden. Programvarukalibrering och justering krävs varje gång kameran eller utrustningen flyttas. Att fånga en mätanordning inom förvärvet förbättrar noggrannheten och underlättar kalibreringen. - Efter kalibrering laddar du varje bildsekvens. Om du väljer auto startas den autonoma tilldelningen av fotavtryck.
- Bläddra igenom varje bildruta i sekvensen och korrigera misstilldelade fotavtryck manuellt. Spara när det här steget är klart.
- Välj slutligen utvärdera för att bearbeta fotavtrycksposition och tryckdata. En serie diagram, bilder och ett kalkylblad med kvantitativa gångmått exporteras till en resultatmapp.
7. Analys av data
- Använd kalkylbladet som exporteras i slutet av varje utvärdering som innehåller kvantitativa gångdata för varje körning. Sammanfoga data från varje körning och genomsnitt per råtta. Plotta medelvärdet och testa signifikansen med GraphPad Prism version 7.0a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Underhåll av råttkoloni
Genereringen och karakteriseringen av Pink1 och Parkin enstaka KO-råttor har beskrivits tidigare22. Pink1 och Parkin enstaka KO-råttor erhölls från SAGE Labs (och nu tillgängliga från Envigo). DKO-råttor genererades genom att korsa Pink1-/- råttor med Parkin-/- råttor för att erhålla Pink1+/-/Parkin+/- råttor, som blandades för att erhålla Pink1-/-/Parkin-/- råttor (kommer att finnas tillgängliga från Envigo). För att bekräfta deletionen av 26 bp i Park6 (genkodande för Pink1) utfördes genotypning med användning av 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' framåt och 5'-CCACCACCCACTACCACTTACT-3' omvända primrar. Deletion av 5 bp i Park2 (genkodande Parkin) testades efter att DNA amplifierats med hjälp av en framåt 5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGTGA-3' och omvänd 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3'. PCR-prover (Amplified Polymerase Chain Reaction) skickades till ACGT Inc (Wheeling, IL) för sekvensering (figur S7). Alla råttor hölls på Long Evans Hooded (LEH) bakgrund. DKO-råttor var livskraftiga och fertila; Det fanns dock en hög dödlighet bland DKO-dammar vid tidpunkten för förlossningen (cirka 30%). Endast hanråttor användes i dessa experiment. Råttor hölls i en temperaturkontrollerad miljö med en 12-timmars ljus / mörk cykel och fri tillgång till råttchow och vatten.
Resultat
För att tjäna som ett exempel på användbarheten av FTIR-gånganalyssystemet för råttor, anpassat från14, utförde vi gånganalys på manliga WT och Pink1 / Parkin DKO-råttor vid 2 månaders ålder för att avgöra om användningen av kinematisk gånganalys kunde avslöja subtila motoriska funktionsnedsättningar som inte observerades med mänsklig visuell uppfattning före uppkomsten av grovmotoriska problem som började vid 4 månaders ålder.
I likhet med tidigare gångstudier på möss14 kunde det anpassade FTIR-systemet visa fotavtrycksmönstret som skapades av den gående råttan samt den väg som skapades av kroppscentret (figur 1A). Trots den ökade vikten av DKO-råttorna jämfört med WT (figur 1B) var fottrycket som applicerades på gångytan (visualiserat som värmekartor) som bestämdes av FTIR-signalens intensitet oförändrat (figur 1C). Vid bedömning av flera gångparametrar som en funktion av gånghastighet (figur 1D-H) observerade vi att gånghastigheten och steglängderna var likartade mellan WT- och DKO-råttor (figur 1D). Variationen mellan WT- och DKO-råttor blev dock tydlig i hållningsfas och svängningstid vid långsammare gånghastigheter (figur 1E, F). Bråkdelen av stegcykeln där benet befinner sig i hållningsfasen (hållningstid / period) är arbetsfaktorn, och denna parameter belyser mer tid som spenderas i svängfasen än i hållningsfasen när arbetsfaktorn minskar, typiskt för löpning (figur 1G). Återigen markeras skillnader vid lägre hastigheter. Vidare, medan svänghastigheterna ökar med ökad hastighet hos WT-djur, trubbas korrelationen av hos DKO-råttor (figur 1H).
FTIR-gånganalysen möjliggjorde också diagram över hållningsfasspår av varje ben i förhållande till kroppen hos fritt gående råttor (figur 2A, B). Hållningsspåren normaliseras till kroppslängd och definieras som fotens position i förhållande till kroppscentrum från tasstouchdown (främre extremläge, AEP) till slutet av hållningsfasen (bakre extremposition, PEP). Vid jämförelse av tasspositioneringen observerade vi signifikanta förändringar i AEP (vänster bakben) och PEP (höger bakben) vilket tyder på att vänster bakben är närmare kroppen under tasstouchdown (AEP), medan höger bakben är längre bort från kroppen under tassstart (PEP) i DKO jämfört med WT-råttor (figur 2C).
Flera ytterligare parametrar ändrades signifikant hos DKO-råttorna jämfört med WT. I synnerhet upptäcktes förändringar i bakbenens svängmönster. Svänghastigheten för både vänster och höger bakben ökade hos DKO-råttor jämfört med WT-råttor (figur 3A), medan svängningstiden för både vänster och höger bakben minskade (figur 3B). Observera att steglängden var oförändrad (figur 4).
Figur 1. Analys av fotavtrycksmönster och stegparametrar. Representativa fotavtrycksmönster för (A) WT- och (B) DKO-råttor som visar (övre panelen) värmekarta för fotavtryck som representerar pixelintensitet och horisontell linje som representerar kroppsvägen samt (nedre panelen) enskilda fötter märkta med olika färger: vänster fram (LF, gul), vänster bak (LH, blå), höger fram (RF, orange) och höger bak (RH, grön). (C) Genomsnittlig gånghastighet för varje WT (n = 7) och DKO (n = 8) råtta. Medel med SEM. Inte signifikant. (D-H) Stegparametrar som en funktion av hastigheten hos WT (n = 7) och DKO (n = 8) råttor. Linjära regressionslinjer och R-kvadratvärden ingår. (D) Steglängden ökar med hastigheten hos WT- och DKO-råttor. (E) Svängningstiden är omvänt proportionell mot hastigheten hos WT-råttor, men inte hos DKO-råttor (är inte signifikanta). (F) Hållningstiden minskar med hastigheten hos WT- och DKO-råttor. (G) Driftsfaktorn är omvänt proportionell mot hastigheten hos DKO-råttor, men inte WT-råttor (är inte signifikanta). (H) Svänghastigheten ökar linjärt med hastigheten hos WT-råttor, men inte DKO-råttor (är inte signifikanta). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Analys av ställningsspår och tasspositionering. (A) Representativ gångvägsanalys för en WT-råtta (före och efter bakgrundskorrigering) visualiserad med nos (röd fast), huvudkontur (blå streckad), svanskontur (grön streckad), kroppscentrum (vit streckad) och fotavtryck (cirklar: grön, RF och ljusblå, LH). (B) Representativa diagram med hållningsspår för fritt gående WT- och DKO-råttor. (C) Tasspositionering hos råttor med WT (n = 7) och DKO (n = 8) visas. AEP, främre extrem position; PEP, bakre extrem position; L, vänster; R, höger; F, framtass; H, baktass. Medelvärde med SEM. Signifikant jämfört med WT (p < 0,05*, 0,001***) med tvåvägs ANOVA och Sidaks multipeljämförelsetest. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Baktassvingparametrar förändrade hos DKO-råttor. Forepaw och bakpote mätningar av (A) hastighet med vilken tassar rör sig och (B) tidstassar är luftburna i WT (n = 7) och DKO (n = 8) råttor. L, vänster; R, höger; F, framtass; H, baktass. Medelvärde med SEM. Signifikant jämfört med WT (p < 0,01 **) med Students oparade tvåsidiga t-test med Welchs korrigering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Steglängden oförändrad hos DKO-råttor. Forepaw och bakpot-mätningar av steglängden hos WT (n = 7) och DKO (n = 8) råttor. L, vänster; R, höger; F, framtass; H, baktass. Medelvärde med SEM. Signifikant jämfört med WT (inte signifikant) med Students oparade tvåsidiga t-test med Welchs korrigering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell. Klicka här för att ladda ner tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gångstörningar, inklusive minskad armsvängning, långsammare gånghastighet och kortare steg, är ett definierande drag hos PD och uppträder tidigt under sjukdomsförlopp 1,5. Flera metoder har utvecklats under åren för att observera och registrera fotfall för gånganalys i gnagarmodeller av PD, med manuella tekniker för kvantifiering av fotfallsposition som leder till automatiserade tillvägagångssätt som är känsligare och kan fånga dynamiska parametrar. Vissa statiska tillvägagångssätt involverar "bläckning" gnagares tassar med en indikator som ska spåras på media placerad på en gångväg24,25,26. De återstående fotfallen kvantifieras senare för hand. Dessa metoder används ofta i samband med videoinspelning för manuell kinematisk poängsättning. Autonoma metoder för att fånga och kvantifiera gångmönster introducerades nyligen15,16 och finns tillgängliga kommersiellt. Autonom gångkvantifiering lägger till tidsmässiga attribut till annars statiska fotavtryck, vilket gör det möjligt för utredare att leta efter avvikelser som tillskrivs hastighet och tid utöver avstånd och vinkel27. Trycket är också kvantifierbart när det kombineras med FTIR-metoden.
Avvikelser i gångmönster har också rapporterats i toxininducerade råttmodeller av PD. I synnerhet har gångförändringar rapporterats i 6-OHDA-lesionsmodellen med hjälp av en kommersiell gånganalysplattform28,29,30. Den mest framträdande förändringen i denna modell har varit nedgångar i gånghastighet och kadens. Vidare har den kommersiella gånganalysplattformen använts för att bedöma ett antal dynamiska och statiska gångparametrar för PD-modeller, såsom effekten av ensidiga 6-OHDA-inducerade lesioner och hur transplantation av dopaminerga neuroner räddar gångförändringarna31. Dessutom har en studie analyserat förhållandet mellan parametrar från 6-OHDA-lesioner i skadade kontra oskadade sidor av hjärnan, samtidigt som man korrigerar för hastighet i relaterade parametrar som bakbenets stegcykel, bakbenets tryckområde och stegsekvens, som alla förändras signifikant när man jämför olika typer av lesioner med saltlösningskontroller32 . Det är dock viktigt att notera att den patogenetiska bakgrunden till toxininducerade modeller är av toxisk natur snarare än en neurodegenerativ process som i human PD6, och som sådan gångbedömning efter lesionsinduktion kan efterlikna avancerad PD när neuroner går förlorade men göra studier av tidiga motorförändringar svårare.
Gånggeometri har mätts i Pink1 KO, Parkin KO och DJ-1 KO råttor22, modeller av ärftlig PD, som uppvisar en progressiv nigral dopaminerg neuronförlust med åldrande. Gång mättes med hjälp av den kommersiella NeuroCube-apparaten, där råttorna får gå i en cirkel och titta på geometri och dynamiska egenskaper. Pink1 och DJ-1 KO-råttor visade kortare varaktighet i steg, swing och hållning jämfört med WT vid 4 och 8 månader.
Eftersom kommersiella gånganalyssystem är kostsamma och levereras med proprietära analyspipelines, sökte vi ett öppet alternativ för vår studie av ärftliga råttmodeller av PD. MouseWalker-systemet14, som levereras med bygginstruktioner och programvara med öppen åtkomst, fångar alla parametrar för kommersiell utrustning avsedd för små gnagare. Eftersom plattformen var för liten för att konsekvent uppnå acceptabla resultat med vuxna råttor, dvs fyra oavbrutna steg under rörelse i gånghastighet, skalade vi om hårdvaran för att rymma råttor. Dessutom använde vi en inhemsk actionkamera istället för en kommersiell höghastighetsvideolösning.
Lägre bildtäthet var en potentiell fallgrop med att använda en actionkamera istället för en höghastighetskamera. Kvalitetströskeln i inhemsk videografi stiger dock snabbt och kan spela in med 120 fps i hög upplösning. Dessutom kan linsförvrängning korrigeras under inspelning av kameraprogramvara som producerar ett konsekvent linjärt synfält (FOV).
Vi var ursprungligen oroade över tryckdynamiken att använda en liknande tjocklek av akryl för gångvägen med en bredare bas och tyngre djur, och programvarans förmåga att bearbeta video av större djur i ett bredare FOV. Vi spekulerar i att massintervallet mellan möss och råttor faller inom känslighetsområdet för akryl FTIR-plattformen, vilket gör att vi kan mäta råttor under hela deras livscykel. Dessutom är det möjligt att potentiell pixelutspädning kan kompenseras av den högre ytan på råttornas tassavtryck i förhållande till den yta som fångats i FOV, om det finns någon signifikant skillnad alls. Med korrekt kalibrering, som dokumenterats här, kunde den fritt tillgängliga programvaran14 bearbeta råttgångvideo enligt beskrivningen.
Med detta protokoll kunde vi visa att FTIR-musgångsystemet14 modifierat här för råttor kan upptäcka förändringar i gång före visuell observation av bakben som drar i manliga DKO-råttor. Observera att den uppenbara visuellt uppenbara motoriska nedsättningen (bakbenssläpning) som observerats hos DKO-råttor tidigare har rapporterats hos manliga Pink1 enstaka KO-råttor22. Medan manliga DKO-råttor uppvisar visuellt observerbar bakbensdragning från 4-6 månaders ålder, avslöjade gånganalysen rörelseförändringar vid 2 månaders ålder. I synnerhet hittades förändringar i bakbenets gångparametrar. DKO-råttor uppvisar ökad bakbenshastighet (både vänster och höger) och en tillhörande minskning av bakbenets (både vänster och höger) svängningstid. Vidare placerar DKO-råttorna sin vänstra baktass närmare kroppen under tasstouchdown, medan den högra baktassen är längre bort från kroppen under tassstart. Medan vi inte upptäckte förändringar i steg eller hållningstid hos DKO-råttor vid 2 månader, var svängtiden kortare hos DKO-råttor som på liknande sätt rapporteras hos Pink1 och DJ-1 KO-råttor22. Sammantaget tyder dessa förändringar på att bakbenens gångparametrar ändras innan bakbenen släpar hos DFO-hanråttor. Framtida longitudinella gångstudier som spårar utvecklingen av rörelseförändringar kommer att hjälpa till att fastställa den ålder då gångförändringar blir signifikanta.
I denna studie visade vi att ett FTIR-musgångsystem14 modifierat här för studier av råttor kan användas för att skilja förändringar i gångparametrar hos 2 månader gamla manliga DKO-råttor, en modell för ärftlig PD, jämfört med åldersmatchade WT-råttor. Tidigare studier på PD-patienter visade minskad steglängd och lägre genomsnittlig svingtid, samt ökad stegtidsvariabilitet och svängtidsvariabilitet4. Således verkar våra resultat av förändringar i svängtid hos DKO-råttor och tidigare rapporter om svängtidsförändringar hos Pink1 KO- och DJ-1 KO-råttor22 relevanta för PD-progression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
KS och HF tackar Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research för stöd till deras arbete med Parkinsons sjukdom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al.
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- Fahn, S. Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson's disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson's disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson's Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F.
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson's disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson's disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson's Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
