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Bioengineering

ARN polymérase attachée à l’ADN pour la transcription in vitro programmable et le calcul moléculaire

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/62073
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto

Summary

Nous décrivons l’ingénierie d’une nouvelle ARN polymérase T7 attachée à l’ADN pour réguler les réactions de transcription in vitro. Nous discutons des étapes de la synthèse et de la caractérisation des protéines, validons la régulation transcriptionnelle de la preuve de concept et discutons de ses applications en informatique moléculaire, en diagnostic et en traitement de l’information moléculaire.

Abstract

La nanotechnologie de l’ADN permet l’auto-assemblage programmable des acides nucléiques en formes et dynamiques prescrites par l’utilisateur pour diverses applications. Ces travaux démontrent que les concepts de la nanotechnologie de l’ADN peuvent être utilisés pour programmer l’activité enzymatique de l’ARN polymérase T7 dérivée des phages (RNAP) et construire des réseaux de régulation de gènes synthétiques évolutifs. Tout d’abord, un RNAP T7 attaché à un oligonucléotide est conçu par l’expression d’un RNAP marqué SNAP N-terminal et le couplage chimique ultérieur du marqueur SNAP avec un oligonucléotide modifié par benzylguanine (BG). Ensuite, le déplacement des brins d’acide nucléique est utilisé pour programmer la transcription de la polymérase à la demande. En outre, les assemblages auxiliaires d’acides nucléiques peuvent être utilisés comme « facteurs de transcription artificiels » pour réguler les interactions entre l’ARNP T7 programmé par l’ADN et ses modèles d’ADN. Ce mécanisme de régulation de la transcription in vitro peut mettre en œuvre une variété de comportements de circuit tels que la logique numérique, la rétroaction, la cascade et le multiplexage. La composabilité de cette architecture de régulation des gènes facilite l’abstraction, la normalisation et la mise à l’échelle de la conception. Ces caractéristiques permettront le prototypage rapide de dispositifs génétiques in vitro pour des applications telles que la biodétection, la détection de maladies et le stockage de données.

Introduction

Le calcul de l’ADN utilise un ensemble d’oligonucléotides conçus comme support de calcul. Ces oligonucléotides sont programmés avec des séquences pour s’assembler dynamiquement selon la logique spécifiée par l’utilisateur et répondre à des entrées d’acide nucléique spécifiques. Dans les études de preuve de concept, le résultat du calcul consiste généralement en un ensemble d’oligonucléotides marqués par fluorescence qui peuvent être détectés par électrophorèse sur gel ou lecteurs de plaques de fluorescence. Au cours des 30 dernières années, des circuits de calcul de l’ADN de plus en plus complexes ont été démontrés, tels que diverses cascades logiques numériques, des réseaux de réactions chimiques et des réseaux de neurones1,2,3. Pour aider à la préparation de ces circuits d’ADN, des modèles mathématiques ont été utilisés pour prédire la fonctionnalité des circuits de gènes synthétiques4,5, et des outils informatiques ont été développés pour la conception de séquences d’ADN orthogonales6,7,8,9,10 . Par rapport aux ordinateurs à base de silicium, les avantages des ordinateurs à ADN comprennent leur capacité à s’interfacer directement avec les biomolécules, à fonctionner en solution en l’absence d’alimentation électrique, ainsi que leur compacité et leur stabilité globales. Avec l’avènement du séquençage de nouvelle génération, le coût de la synthèse des ordinateurs à ADN a diminué au cours des deux dernières décennies à un rythme plus rapide que la loi de Moore11. Des applications de ces ordinateurs basés sur l’ADN commencent maintenant à émerger, telles que pour le diagnostic des maladies12,13, pour alimenter la biophysique moléculaire14, et comme plates-formes de stockage de données15.

Figure 1
Figure 1: Mécanisme de déplacement des brins d’ADN médiés par les orteils. L’orteil, δ, est une séquence libre et non liée sur un duplex partiel. Lorsqu’un domaine complémentaire (δ*) est introduit sur un deuxième brin, le domaine δ libre sert de base pour l’hybridation, permettant au reste du brin (ɑ*) de déplacer lentement son concurrent par une réaction réversible de zipping/décompression connue sous le nom de migration de brin. À mesure que la longueur de δ augmente, le ΔG de la réaction vers l’avant diminue et le déplacement se produit plus facilement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

À ce jour, la majorité des ordinateurs à ADN utilisent un motif bien établi dans le domaine de la nanotechnologie dynamique de l’ADN connu sous le nom de déplacement de brin d’ADN médié par les orteils (TMDSD, Figure 1)16. Ce motif est constitué d’un duplex d’ADN partiellement double brin (dsDNA) affichant de courts surplombs « toehold » (c’est-à-dire 7 à 10 nucléotides (nt)). Les brins d’entrée d’acide nucléique peuvent interagir avec les duplex partiels à travers l’orteil. Cela conduit au déplacement de l’un des brins du duplex partiel, et ce brin libéré peut alors servir d’entrée pour les duplex partiels en aval. Ainsi, TMDSD permet la cascade du signal et le traitement de l’information. En principe, les motifs tmDSD orthogonaux peuvent fonctionner indépendamment dans la solution, ce qui permet un traitement parallèle de l’information. Il y a eu un certain nombre de variations sur la réaction TMDSD, telles que l’échange de brins d’ADN médié par la toehold (TMDSE)17,les orteils « sans fuite » avec des domaines doubles longs18,les orteils dépareillés par séquence19et le déplacement de brin médié par la « poignée »20. Ces principes de conception innovants permettent une énergie et une dynamique TMDSD plus finement ajustées pour améliorer les performances de calcul de l’ADN.

Les circuits de gènes synthétiques, tels que les circuits de gènes transcriptionnels, sont également capables de calculer21,22,23. Ces circuits sont régulés par des facteurs de transcription des protéines, qui activent ou répriment la transcription d’un gène en se liant à des éléments d’ADN régulateurs spécifiques. Par rapport aux circuits à base d’ADN, les circuits transcriptionnels présentent plusieurs avantages. Premièrement, la transcription enzymatique a un taux de rotation beaucoup plus élevé que les circuits d’ADN catalytiques existants, générant ainsi plus de copies de sortie par copie unique d’entrée et fournissant un moyen plus efficace d’amplification du signal. En outre, les circuits transcriptionnels peuvent produire différentes molécules fonctionnelles, telles que des aptamères ou des ARN messagers (ARNm) codant pour des protéines thérapeutiques, en tant que sorties de calcul, qui peuvent être exploitées pour différentes applications. Cependant, une limitation majeure des circuits transcriptionnels actuels est leur manque d’évolutivité. En effet, il existe un ensemble très limité de facteurs de transcription basés sur des protéines orthogonales, et la conception de novo de nouveaux facteurs de transcription protéique reste techniquement difficile et prend beaucoup de temps.

Figure 2
Figure 2: Abstraction et mécanisme du complexe de polymérase « attache » et « cage ». (A et B) Une téther oligonucléotidique est marquée enzymatiquement en une polymérase T7 par la réaction SNAP-tag. Une cage constituée d’un « faux » promoteur T7 avec un porte-à-faux attache-complément lui permet de s’hybrider à l’attache et de bloquer l’activité transcriptionnelle. (C) Lorsque l’opérateur (a*b*) est présent, il se lie à l’orteil sur l’attache oligonucléotidique (ab) et déplace la région b* de la cage, permettant la transcription. Cette figure a été modifiée à partir de Chou et Shih27. Abréviations : RNAP = ARN polymérase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cet article présente un nouveau bloc de construction pour l’informatique moléculaire qui combine les fonctionnalités des circuits transcriptionnels avec l’évolutivité des circuits à base d’ADN. Ce bloc de construction est un RNAP T7 attaché de manière covalente avec une attache d’ADN simple brin(Figure 2A). Pour synthétiser ce RNAP T7 attaché à l’ADN, la polymérase a été fusionnée à un marqueur SNAP N-terminal24 et exprimée de manière recombinante dans Escherichia coli. Le SNAP-tag a ensuite réagi avec un oligonucléotide fonctionnalisé avec le substrat BG. L’attache oligonucléotidique permet le positionnement d’invités moléculaires à proximité de la polymérase via l’hybridation de l’ADN. L’un de ces invités était un bloqueur transcriptionnel compétitif appelé « cage », qui consiste en un « faux » duplex d’ADN promoteur T7 sans gène en aval(Figure 2B). Lorsqu’elle est liée à l’ARNP via son attache oligonucléotidique, la cage bloque l’activité de la polymérase en surpassant les autres modèles d’ADN pour la liaison À l’ARNP, rendant l’ARNP dans un état « OFF »(Figure 2C).

Pour activer la polymérase à un état « ON », des modèles d’ADN T7 avec des domaines « opérateurs » monocaténaires en amont du promoteur T7 du gène ont été conçus. Le domaine de l’opérateur (c’est-à-dire le domaine a*b* Figure 2C) peut être conçu pour déplacer la cage de l’ARNP via TMDSD et positionner le RNAP proximal au promoteur T7 du gène, initiant ainsi la transcription. Alternativement, des modèles d’ADN ont également été conçus lorsque la séquence de l’opérateur était complémentaire aux brins auxiliaires d’acide nucléique appelés « facteurs de transcription artificiels » (c.-à-d. les brins TFA et TFB à la figure 3A). Lorsque les deux brins sont introduits dans la réaction, ils s’assemblent sur le site de l’opérateur, créant un nouveau domaine pseudo-contigu a*b*. Ce domaine peut ensuite déplacer la cage via TMDSD pour initier la transcription(Figure 3B). Ces brins peuvent être fournis de manière exogène ou produits.

Figure 3
Figure 3: Programmation sélective de l’activité de la polymérase à l’aide d’un activateur de commutation à trois composants. (A) Lorsque les facteurs de transcription (TFA et TFB)sont présents, ils se lient au domaine opérateur en amont du promoteur, formant une pseudo séquence monocaténaire (a*b*)capable de déplacer la cage par déplacement d’ADN médié par l’orteil. (B) Ce domaine a*b* peut déplacer la cage via TMDSD pour initier la transcription. Cette figure a été modifiée à partir de Chou et Shih27. Abréviations : TF = facteur de transcription ; RNAP = ARN polymérase; TMDSD = déplacement de brin d’ADN médié par les orteils. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’utilisation de facteurs de transcription à base d’acides nucléiques pour la régulation transcriptionnelle in vitro permet la mise en œuvre évolutive de comportements de circuit sophistiqués tels que la logique numérique, la rétroaction et la cascade de signaux. Par exemple, on peut construire des cascades de portes logiques en concevant des séquences d’acides nucléiques telles que les transcriptions d’un gène en amont activent un gène en aval. Une application qui exploite la cascade et le multiplexage rendus possibles par cette technologie proposée est le développement de circuits informatiques moléculaires plus sophistiqués pour le diagnostic portable et le traitement des données moléculaires. En outre, l’intégration des capacités de calcul moléculaire et de synthèse d’ARN de novo peut permettre de nouvelles applications. Par exemple, un circuit moléculaire peut être conçu pour détecter un ou une combinaison d’ARN définis par l’utilisateur en tant qu’ENTRÉES ET SORTIES D’ARN thérapeutiques ou d’ARNm codant pour des peptides ou des protéines fonctionnels pour des applications médicales au point de service.

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Protocol

1. Préparation du tampon

REMARQUE: La préparation du tampon de purification des protéines peut se produire n’importe quel jour; ici, cela a été fait avant de commencer les expériences.

  1. Préparer un tampon d’lyse/équilibrage contenant 50 mM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris), 300 mM de chlorure de sodium (NaCl), 5 % de glycérol et 5 mM de β-mercaptoéthanol (BME), pH 8. Ajouter 1,5 mL de Tris 1M, 1,8 mL de NaCl 5M, 1,5 mL de glycérol, 25,2 mL d’eau désionisée (ddH2O) dans un tube centrifuge de 50 mL et ajouter 10,5 μL de 14,2 M BME juste avant utilisation.
    REMARQUE: Tris peut causer une toxicité aiguë; par conséquent, évitez de respirer sa poussière et évitez le contact avec la peau et les yeux. Le BME est toxique et ne doit être utilisé que dans une hotte aspirante. Il est important d’ajouter le BME en dernier, juste avant la remise en suspension et la lyse cellulaire. Voir le tableau 1 pour la formule tampon de lyse.
  2. Préparer un tampon de lavage (pH 8) contenant 50 mM de Tris, 800 mM de NaCl, 5 % de glycérol, 5 mM de BME et 20 mM d’imidazole. Ajouter 1,5 mL de Tris de 1 M, 4,8 mL de NaCl de 5 M, 1,5 mL de glycérol et 22,2 mL de ddH2O dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Juste avant utilisation, ajouter 7 μL de 14,2 M BME et 200 μL de 2 M d’imidazole à 20 mL de la solution ci-dessus.
    REMARQUE: Pour prévenir la toxicité aiguë due à l’imidazole, utilisez un équipement de protection individuelle. Il est important d’ajouter le BME et l’imidazole en dernier, juste avant de laver la protéine hors de la colonne. Voir le tableau 2 pour la formule tampon de lavage.
  3. Préparer un tampon d’élution (pH8) contenant 50 mM de Tris, 800 mM de NaCl, 5 % de glycérol, 5 mM de BME et 200 mM d’imidazole. Ajouter 0,5 mL de Tris 1 M, 1,6 mL de NaCl 5 M, 0,5 mL de glycérol et 6,4 mL de ddH2O dans un tube centrifuge de 15 mL. Juste avant utilisation, ajouter 3,5 μL de 14,2 M BME et 1 mL de 2 M d’imidazole à 10 mL de la solution ci-dessus.
    REMARQUE: Il est important d’ajouter le BME et l’imidazole en dernier, juste avant d’éluer la protéine hors de la colonne. Voir le tableau 3 pour la formule du tampon d’élution.
  4. Préparer 2x tampon de stockage (à mélanger 1:1 avec du glycérol) contenant 100 mM de Tris, 200 mM de NaCl, 40 mM de BME et 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), soit 0,2 % d’un tensioactif non ionique (voir la Table des matières). Préparer 50 mL du tampon de stockage en ajoutant 5 mL de 1 M Tris, 2 mL de 5 M NaCl, 42,56 mL de ddH2O, 200 μL de 0,5 M EDTA, 100 μL du tensioactif non ionique dans un tube centrifuge de 50 mL. Mélanger jusqu’à ce que la solution soit homogène, filtrer le tampon de stockage à travers un filtre à seringue de 0,2 μm et ajouter 140,8 μL de BME à la solution ci-dessus avant utilisation.
    REMARQUE: Pour éviter la toxicité aiguë due à l’EDTA, évitez de respirer sa poussière et évitez le contact cutané et oculaire. Il est important d’ajouter le BME en dernier et de mélanger tout le tampon de stockage 1: 1 avec du glycérol, juste avant de stocker la protéine purifiée. Reportez-vous au tableau 4 pour connaître la formule de la mémoire tampon de stockage.

2. Croissance culturelle du jour au lendemain : Jour 1

  1. Préparer 1 000x de kanamycine en dissolvant 500 mg de kanamycine dans 10 mL de ddH2O.
    REMARQUE: Utilisez un équipement de protection individuelle pour prévenir la toxicité aiguë due à la kanamycine.
  2. Ajouter 20 μL du bouillon de kanamycine 1 000x à 20 mL de bouillon de lysogénie. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, piquez un bouillon de glycérol BL21 E. coli transformé, puis inoculez la culture en introduisant la pointe dans le bouillon du milieu de croissance.

Figure 4
Figure 4: Carte plasmidique pour SNAP T7 RNAP. Le plasmide code un RNAP T7 contenant une balise histidine N-terminale (6x His) et un domaine SNAP-tag (SNAP T7 RNAP) sous un répresseur lac (lacI) sur une dorsale pQE-80L. D’autres caractéristiques incluent la résistance à la kanamycine (KanR) et les gènes de résistance au chloramphénicol (CmR). Abréviation : RNAP = ARN polymérase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

REMARQUE: Le plasmide code un RNAP T7 contenant une étiquette d’histidine N-terminale et un domaine de balise SNAP (SNAP T7 RNAP), ainsi qu’un gène de résistance à la kanamycine sous un squelette pQE-80L (Figure 4)25.

  1. Encore une fois, ajoutez 20 μL du bouillon de kanamycine 1 000x dans une fiole de culture séparée contenant 20 mL de bouillon de lysogénie et incubez-la comme témoin.
  2. Incuber les deux échantillons (des étapes 2.2 et 2.3) pendant la nuit pendant 12 à 18 h à 37 °C, tout en tournant à 10 × g.

3. Croissance et induction cellulaires : Jour 2

  1. Inoculer 400 mL de bouillon de lysogénie contenant 400 μL de bouillon de kanamycine avec 4 mL de culture de croissance pendant la nuit à partir de l’étape 2.4. Incuber les flacons de culture à 37 °C, tout en tournant à 10 × g.
  2. Une fois que la culture a atteint une densité optique (OD) à 600 nm d’environ 0,5, prélever 1 mL d’échantillon de la fiole de croissance comme témoin. Conserver l’échantillon de contrôle à 4 °C.
  3. Induire les cellules avec de l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en ajoutant 40 μL de 1M IPTG par 100 mL de culture pour atteindre une concentration finale de 0,4 mM IPTG. Incuber l’échantillon pendant 3 h à 37 °C, en tournant à 10 × g,puis faire tourner la culture induite à 8 000 × g pendant 10 min pour granuler les cellules. Retirez le surnageant et conservez la pastille à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
    REMARQUE: Pour éviter la toxicité aiguë due à l’IPTG, évitez de respirer sa poussière et évitez le contact avec la peau et les yeux. Si nécessaire, vous pouvez mettre l’expérience en pause ici et continuer le lendemain.

4. Lyse cellulaire, purification des protéines : Jour 3

  1. Remettez en suspension la pastille de cellule stockée avec 10 mL de tampon de lyse sur de la glace et tourbillonnez doucement pour vous assurer que la pastille entière est remise en suspension. Ensuite, pipettez 1 mL d’échantillon dans dix tubes de 1,5 mL qui sont conservés sur de la glace.
  2. Soniquer chaque échantillon à un réglage d’amplitude de « 1 », pulsé pendant 2 s avec un rapport cyclique de 50% sur une période de 30 s. Avant et après chaque échantillon, nettoyez l’embout de sonication avec 70% d’éthanol et ddH2O. Conservez tous les échantillons sur de la glace pendant et après la sonication.
    REMARQUE: Gardez 70% d’éthanol à l’abri de la chaleur et de la flamme nue.
  3. Équilibrer une colonne de spin de purification à l’acide nitrilotriacétique chargé de nickel (Ni-NTA) à une température de fonctionnement de 4 °C. Placez/rangez la colonne à 4 °C et conservez-la sur la glace pendant l’utilisation.
  4. Centrifuger les dix échantillons de 1 mL à 15 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Pipettez soigneusement le surnageant contenant le RNAP recombinant sans perturber la pastille. Si nécessaire, utilisez un tampon d’équilibrage supplémentaire pour régler le volume total à ≥ 6 mL.
  5. Retirez délicatement la languette inférieure de la colonne de rotation Ni-NTA pour permettre l’écoulement dans la colonne. Placez la colonne dans un tube de centrifugeuse et gardez-la sur la glace.
    REMARQUE: Utilisez un tube de centrifugeuse de 50 mL avec les colonnes de spin Ni-NTA de 3 mL.
  6. Centrifuger la colonne à 700 × g et 4 °C pendant 2 min pour retirer le tampon de stockage. Équilibrez la colonne en ajoutant 6 mL de tampon d’équilibrage à la colonne. Laissez le tampon pénétrer complètement dans le lit de résine.
  7. Retirer le tampon d’équilibrage de la colonne par centrifugation à 700 × g et 4 °C pendant 2 min. Avant d’ajouter l’extrait de cellule préparé à la colonne, placez un bouchon inférieur sur la colonne pour éviter de perdre du produit. Ensuite, ajoutez l’extrait de cellule à la colonne et mélangez sur un mélangeur à agitateur orbital pendant 30 min à 4 °C.
  8. Retirez le bouchon inférieur de la colonne et placez la colonne dans un tube de centrifugeuse de 50 mL étiqueté à travers. Centrifuger la colonne à 700 × g pendant 2 min pour recueillir le débit.
  9. Ajouter 6 mL de tampon de lavage à la colonne pour laver la résine. Centrifuger la colonne à 700 × g pendant 2 min pour recueillir la fraction dans un nouveau tube de centrifugeuse étiqueté lavage 1. Répétez cette étape deux fois de plus pour un total de 3 fractions distinctes, et collectez les fractions dans des tubes centrifuges séparés(lavage 2 et lavage 3).
  10. Ajouter 3 mL de tampon d’élution pour éluer les protéines marquées His de la résine. Centrifuger la colonne à 700 × g pendant 2 min pour recueillir la fraction dans un nouveau tube de centrifugeuse étiqueté éluat 1. Répétez cette étape deux fois de plus pour un total de 3 fractions distinctes, et collectez les fractions dans des tubes centrifuges séparés(éluer 2 et éluer 3).
  11. Mélanger les éluats et effectuer le dessalement pour éliminer les sels de la solution protéique.
    1. Pipette 15 mL de 0,05 % p/v polysorbate 20 sur une unité de filtration centrifuge de 100 kDa. Centrifuger à 4 000 × g pendant 40 min et jeter le flux.
    2. Utilisez le filtre revêtu pour concentrer les éluats 1, 2 et 3 (9 mL d’éluat de protéine total + 6 mL de tampon de stockage) à environ 1 500 μL. Centrifugez le filtre à 3 220 × g pendant 20 min et lavez doucement la membrane à la pipette pour éviter les précipitations.
    3. Diluer l’échantillon à 15 mL avec un tampon de stockage. Effectuez un échange de mémoire tampon à l’aide de la mémoire tampon de stockage 1:1 000 en répétant l’étape 4.11.2 deux fois de plus.
  12. Quantifier la protéine purifiée en mesurant l’absorbance de la fraction à 280 nm. Vider le spectrophotomètre avec un tampon de stockage (2x tampon de stockage à 4 °C). Mélangez doucement l’échantillon des éluats combinés et mesurez son absorbance.
    REMARQUE: Effectuez trois lectures distinctes à des dilutions 1x, 10x et 50x de l’échantillon de protéines pour faire la moyenne et quantifier la protéine. Diluer les échantillons dans un tampon de stockage.
  13. Ajustez les échantillons de protéines à 100 μM à l’aide d’un tampon de stockage 2x. Diluer l’échantillon ajusté 1:1 en volume avec 100% de glycérol. Conserver la solution protéique obtenue à -80 °C.

5. Analyse par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) du produit protéique : Jour 3

  1. Exécutez un gel SDS-PAGE pour l’analyse des protéines. Mélanger 9 μL de l’échantillon avec 3 μL de 4x colorant de charge protéique de dodécylsulfate de lithium (LDS). Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 10 min.
  2. Chargez les échantillons sur une configuration de gel Bis-Tris SDS-PAGE à 4-12%. Chargez l’échelle protéique dans le puits 1, puis avec des échantillons (de gauche à droite): écoulement, lavage 1, lavage 2, lavage 3, élution 1, élution 2, élution 3 et élution dessalée totale.
    REMARQUE : Le tableau 5 contient un exemple de table de chargement pour le gel SDS-PAGE.
  3. Exécutez les échantillons de gel chargés dans un tampon d’acide éthanesulfonique (MES)2(N-morpholino)pendant 35 min à 200 V. Rincez le gel dans un bac propre trois fois pendant 10 min chacun en utilisant 200 mL de ddH2O, avec une agitation douce pour éliminer toute FDS de la matrice de gel.
    REMARQUE: Portez un équipement de protection individuelle pour éviter la toxicité aiguë due au MES.
  4. Tacher le gel avec 20 mL de bleu coomassie et incuber le gel pendant la nuit à température ambiante avec une légère agitation. Décolorez le gel deux fois pendant 1 h chacun avec 200 mL de ddH2O avec une légère agitation sur un agitateur orbital.
    REMARQUE: Laver le gel pendant une période plus longue ou remplacer fréquemment l’eau augmentera la sensibilité. De plus, placer un tissu d’essuyage plié à tâche délicate dans le récipient pour absorber l’excès de colorant accélérera le processus de décoloration.

6. Vérification fonctionnelle de SNAP T7 RNAP par transcription in vitro

REMARQUE: Ce protocole utilise un modèle d’ADN, qui code pour l’aptamère fluorescent de l’ARN du brocoli et permet l’utilisation de la fluorescence pour surveiller la cinétique de transcription sur un lecteur de plaque de fluorescence.

  1. Mettre en place trois réactions de transcription in vitro (IVT) pour comparer l’activité du SNAP T7 RNAP avec le RNAP T7 de type sauvage (WT) provenant d’une source commerciale et d’un contrôle tampon uniquement. Réglez le volume de chaque réaction à 20 μL.
    1. Préparer la réaction SNAP T7 RNAP IVT en mélangeant 2 μL de tampon de transcription 10x, 0,4 μL de mélange de 25 mM de ribonucléoside triphosphate (rNTP), 5 μL de 500 nM de gabarit d’ADN, 2 μL de 500 nM SNAP T7 RNAP et 10,6 μL de ddH2O.
    2. Préparer la réaction WT RNAP IVT en mélangeant 2 μL de tampon de transcription 10x, 0,4 μL de mélange rNTP de 25 mM, 5 μL de modèle d’ADN 500 nM, 2 μL de WT T7 RNAP et 10,6 μL de ddH2O.
    3. Préparer la réaction IVT tampon uniquement en mélangeant 2 μL de tampon de transcription 10x, 0,4 μL de mélange rNTP de 25 mM, 5 μL de modèle d’ADN 500 nM et 12,6 μL de ddH2O.
      REMARQUE: Ajoutez le RNAP en dernier, en gardant les échantillons sur la glace jusqu’à son introduction. Les tableaux 6, 7et 8 contiennent les formules de réaction IVT.
  2. Surveiller la cinétique de transcription sur un lecteur de plaque de fluorescence pendant 2 h à des intervalles de 2 min à 37 °C en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 470 nm et une longueur d’onde d’émission de 512 nm.

7. Préparation d’oligonucléotides modifiés par BG: Jour 1

  1. Dissoudre l’oligonucléotide avec modification de la3'-amine dans la ddH2 O jusqu’à une concentration finale de 1 mM. Étiquetez ce S1.
    1. Mélanger 25 μL de 1 M de bicarbonate de sodium (NaHCO3),284 μL de sulfoxyde de diméthyle à 100 % (DMSO), 125 μL de S1 (stock d’oligonucléotides) et 66 μL de 50 mM d’ester BG-N-hydroxysuccinimide (NHS) (BG-GLA-NHS) dilué avec du DMSO, ajuster le volume à 500 μL et incuber toute la nuit à température ambiante à 100 × g.
      REMARQUE: Gardez le DMSO à l’écart de la chaleur et des flammes car il s’agit d’un liquide combustible. Le tableau 9 contient la formule de réaction pour la conjugaison BG à l’oligonucléotide.

8. Précipitation éthanol/acétone du conjugué BG-oligonucléotide : Jour 2

  1. Centrifuger le produit de l’étape 7.1.1. à 13 000 × g pendant 5 min. Transférer soigneusement le surnageant dans un tube frais et jeter tout BG précipité. Divisez la réaction en deux aliquotes égales de 250 μL pour éviter tout débordement et effectuez les étapes suivantes sur les deux aliquotes.
  2. Ajouter 1/10ème du volume d’acétate de sodium 3 M (25 μL), suivi de 2,5x le volume en éthanol à 100% (625 μL). Incuber à -80 °C pendant 1 h.
    REMARQUE: Utilisez un équipement de protection individuelle lorsque vous manipulez à la fois de l’acétate de sodium (peut causer une irritation des yeux, de la peau, des voies digestives et respiratoires) et de l’éthanol (extrêmement inflammable, provoque une irritation au contact). Si nécessaire, mettez l’expérience en pause ici et continuez le lendemain.
  3. Placez les tubes dans la centrifugeuse et marquez le bord extérieur. Centrifuger les tubes à 17 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
    REMARQUE: La pastille d’oligonucléotide apparaîtra sur le bord marqué du tube.
  4. Sans déranger la pastille, jetez le surnageant. Complétez avec 750 μL d’éthanol réfrigéré à 70 % et faites tourner à 17 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
  5. Sans déranger la pastille, jetez le surnageant. Complétez avec 750 μL d’acétone à 100 % et faites tourner à 17 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE: Utilisez un équipement de protection individuelle lorsque vous manipulez de l’acétone, car elle est extrêmement inflammable et provoque une irritation au contact.
  6. Avec le couvercle du tube ouvert, sécher à l’air libre pendant 5 min pour éliminer tout excès d’acétone par évaporation. Dissoudre à nouveau l’oligonucléotide dans 250 μL de 1x tampon Tris-EDTA (TE) pour produire une solution d’oligonucléotide BG d’environ 850 μM.
  7. Répétez les étapes 8.2 à 8.6 et dissolvez à nouveau dans 70 μL de tampon TE 1x. Étiquetez ce S2.

9. Nettoyage des bg-oligonucléotides par chromatographie par filtration sur gel

  1. Suspendre la matrice en inversant vigoureusement les colonnes plusieurs fois; retirez le capuchon supérieur et enclenchez l’extrémité inférieure de la colonne. Placez la colonne dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL et centrifugez le tube à 1 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le tampon élué et le tube de collecte.
    REMARQUE: Il est important d’empêcher la formation de vide. Utilisez immédiatement les colonnes préparées.
  2. Placez les colonnes emballées dans des tubes de centrifugeuse propres de 1,5 mL. Ajouter 300 μL de tampon TE 1x au centre du lit de colonne et centrifuger à 1 000 × g pendant 2 min pour échanger la solution tampon. Encore une fois, jetez le tampon élué et le tube de collecte.
  3. Placez les colonnes échangeuses tampons dans des tubes centrifuges propres de 1,5 mL. Appliquer jusqu’à 75 μL d’échantillon au centre du lit. Tourner à 1 000 × g pendant 4 min.
    REMARQUE: Ne pas déranger le lit ou toucher les côtés de la colonne; le point le plus élevé du support de gel doit pointer vers le rotor extérieur.
  4. Recueillir l’éluat du tube de collecte, car il contient l’acide nucléique purifié. Pour quantifier l’échantillon, mesurer son absorbance à 260 nm; étiquetez ce S3.
    REMARQUE: Notez la longueur du chemin utilisé dans la mesure et calculez la concentration en utilisant la loi de Beer-Lambert.

10. Analyse PAGE dénaturante du conjugué BG-oligonucléotide

  1. Jetez un gel 18% Tris-borate-EDTA (TBE)-Urea PAGE. Dissoudre 4,8 g d’URÉE, 4,5 mL d’acrylamide à 40 % (19:1) et 1 mL de 10x TBE dans 2,8 mL de ddH2O; ajouter 5 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et bien mélanger. Répéter avec 100 μL de persulfate d’ammonium (APS) à 10 %. Versez la solution dans une cassette de gel vide et laissez la polymérisation pendant 40 min.
    REMARQUE: Utilisez l’équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation de l’urée (provoque une irritation des yeux et de la peau), de l’acrylamide (toxique et cancérigène) et du TEMED (toxique, inflammable, corrosif). Le tableau 10 contient la formule de réaction d’un gel de polyacrylamide TBE-UREA à 18 %.
  2. Micro-ondes 500 mL de tampon TBE (0,5x) pendant 2 min et 30 s ou jusqu’à ~70 °C et verser dans un appareil à gel. Préparer un colorant de charge de formamide (dénaturant) contenant 95% de formamide + 1 mM d’EDTA et de bleu de bromophénol. Mélanger le colorant de chargement avec chaque échantillon et charger le mélange sur le gel de polyacrylamide.
    REMARQUE: Utilisez l’équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation du formamide car il est cancérigène. Le tableau 11 contient un exemple de tableau de chargement de gel.
  3. Faites couler le gel à 270 V pendant 35 min, ou jusqu’à ce que le front de teinture migre vers la fin. Placez le gel dans une boîte à gel et colorez avec du colorant cyanine pour les acides nucléiques pendant 15 minutes à température ambiante avant l’imagerie.
    REMARQUE: Utilisez l’équipement de protection individuelle approprié lorsque vous manipulez un colorant cyaniné car il est combustible.

11. Conjugaison de l’oligonucléotide à l’analyse SNAP T7 RNAP et PAGE

  1. Préparer les réactifs pour le couplage à l’échelle analytique de l’oligonucléotide BG à l’ARNP SNAP T7 : effectuer 9 dilutions d’oligo d’ADN simple brin (ADNSS) avec ddH2O pour créer des rapports oligo:RNAP allant de 5:1 à 1:5. Diluer le stock de protéines à 50 μM.
    NOTE: Des exemples de ratios peuvent être trouvés dans le tableau 12; ces rapports sont calculés à l’aide d’une concentration rNAP de 50 μM.
  2. Pour chaque dilution d’oligo d’ADNSs, faire 10 μL du mélange réactionnel contenant 2 μL de tampon SNAP, 4 μL d’oligonucléotide BG et 4 μL de SNAP T7 RNAP.
    REMARQUE : Le tableau 13 contient des formules de réaction pour la réaction d’étiquetage de la balise SNAP.
    1. Préparer deux autres échantillons témoins : 1) un contrôle RNAP en remplaçant BG-oligonucléotide par ddH2O ; 2) un contrôle de l’ADN en remplaçant SNAP T7 RNAP par ddH2O (pour la plus faible concentration d’oligonucléotides de SNAP T7 RNAP). Incuber tous les échantillons à température ambiante pendant 1 h et conserver sur la glace jusqu’à ce que nécessaire.
  3. Mettre en place onze réactions de 10 μL en ajoutant 2 μL de chaque échantillon à 4 μL de tampon SNAP et 2 μL de colorant à charge protéique, et chauffer à 70 °C pendant 10 min. Chargez 2 μL de chaque échantillon sur le gel protéique Bis-Tris à 4-12 % et effectuez l’électrophorèse sur gel sur glace à 200 V pendant 35 min.
    NOTE: Le tableau 14 contient des formules de réaction pour les échantillons de chargement de gel.
    1. Lavez les FDS via 3x échange d’eau sur un agitateur, chaque lavage dure 10 minutes chacun. Coloration avec un colorant cyanine pour les acides nucléiques pendant 15 min avant l’imagerie. Tacher à nouveau le gel en utilisant 20 mL de teinture bleue Coomassie pendant 1 h. Décolorer avec ddH2O pendant 1 h (ou pendant la nuit) avant l’imagerie.
      REMARQUE: Dans le gel, l’une des réactions produira la polymérase la plus attachée avec le moins d’excès d’oligonucléotide BG libre; c’est le ratio optimal.
  4. Préparer des réactifs pour le couplage à l’échelle préparative BG-oligonucléotide à SNAP T7 RNAP. Effectuer la réaction de couplage avec le rapport optimal trouvé dans l’échelle analytique.
    REMARQUE: Minimiser l’exposition aux protéines à la température ambiante en plaçant la protéine sur la glace lorsqu’elle n’est pas utilisée.

12. Purification du SNAP-T7 attaché aux oligonucléotides à l’aide de colonnes d’échange d’ions

  1. Suivez les instructions du fabricant pour la configuration du tube s’il s’écarte des instructions répertoriées ici. Préparez un tampon de purification avec un pH supérieur au point isoélectrique de la protéine.
    NOTE: Pour l’exemple de protéine dans ce protocole, un tampon de purification de 10 mM de tampon phosphate de sodium (pH 7) a été utilisé.
    1. Préparer 1 000 μL de tampon d’élution contenant des concentrations finales de 50 mM de Tris et de 0,5 M de NaCl. Mélanger 50 μL de 1 M Tris, 100 μL de 5 M NaCl et 850 μL de ddH2O.
      NOTE: Le tableau 15 contient la formule de réaction pour le tampon d’élution.
  2. Placer une colonne dans un tube de centrifugeuse de 2 mL et laver avec un tampon de purification à 2 000 × g pendant 15 min, ou jusqu’à ce que tout le tampon ait été élué. Jetez le tampon élué.
  3. Diluer chaque échantillon avec un tampon de purification à un rapport tampon de purification:échantillon de 3:1 et charger l’échantillon dans la colonne 400 μL à la fois. Tourner à 2 000 × g pendant 10 min, ou jusqu’à ce que tout le tampon ait été élué. Collectez le flux traversant et étiquetez-le comme flow-through.
  4. Ajouter 400 μL de tampon de purification au centre de la colonne. Tourner à 2 000 × g pendant 15 min, ou jusqu’à ce que tout le tampon ait été élué. Collectez le flux et étiquetez-le comme lavage 1. Répétez deux fois de plus pour le lavage 2 et le lavage 3.
  5. Ajouter 50 μL de tampon d’élution au centre de la colonne. Tourner à 2 000 × g pendant 5 min, ou jusqu’à ce que tout le tampon ait été élué. Collectez le flux et étiquetez-le comme éluant 1. Répétez deux fois de plus pour éluer 2 et éluer 3.
  6. La piscine élue 1, 2 et 3 (étiquetez cette éluat totale),laissant une petite fraction de chaque éluat pour le gel, et mesurent l’absorbance à 260 nm (A260) et 280 nm (A280). Après la mesure, ajouter le glycérol à un rapport de 1:1 et conserver à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
  7. Utilisez une unité de filtre centrifuge (0,5 mL; 30 kDa) pour échanger un tampon total élué avec 2x tampon de stockage (~ 1:100) (étiquetez ce produit). Mesure A260/280 à nouveau. Ajouter le glycérol à un rapport de 1:1 et conserver à -20 °C jusqu’à nouvel usage.
  8. Chargez chaque éluat : écoulement, lavage 1-3, éluat total et produit dans un gel Bis-Tris SDS-PAGE à 4-12%, accompagné d’une échelle à protéines. Exécuter à 200 V pendant 35 min, ou jusqu’à ce que le front de teinture migre vers la fin.

13. Démonstration du contrôle à la demande de l’activité de l’ARN polymérase attachée

  1. Préparer 5x tampon de recuit contenant 25 mM de Tris, 5 mM d’EDTA et 25 mM de chlorure de magnésium (MgCl2). Mélanger 2,4 μL de chaque gabarit (1 μM) avec 5 μL de tampon de recuit et 14,2 μL de ddH2O pour former 25 μL de cage d’ADNds de 1 μM. Incuber cette solution à 75 °C pendant 2 min. De même, recuit les brins de sens et d’antisens du modèle d’ADN d’aptamère vert promoteur et malachite. Préparer une solution de 1mM d’oxalate vert de malachite.
    REMARQUE: Le tableau 16 contient la formule de réaction pour 5x tampon de recuit, le tableau 17 contient la formule de réaction pour le recuit de deux modèles d’ADNSs.
  2. Incuber le SNAP T7 RNAP attaché avec la cage dsDNA dans un rapport molaire de 1:5 à température ambiante pendant 15 min jusqu’à une concentration finale de 500 nM RNAP. Garder sur la glace jusqu’à ce que nécessaire.
  3. Préchauffez le lecteur de plaques à 37 °C. Mettre en place trois réactions IVT de 25 μL sur la glace
    1. Mettre en place une réaction contenant le SNAP T7RNAP en cage avec des facteurs de transcription d’acides nucléiques. Mélanger 2,5 μL de 10x tampon IVT, 1 μL de mélange rNTP de 25 mM, 1 μL de vert malachite 1 mM, 2,5 μL du mélange RNAP-cage, 2,5 μL chacun des brins d’oligonucléotides du facteur de transcription A et B de 1 μM, et 3 μL de 1 mM de gabarit d’aptamère vert malachite dans 10 μL de ddH2O.
    2. Mettre en place une réaction contenant le SNAP T7RNAP en cage sans facteurs de transcription des acides nucléiques. Mélanger 2,5 μL de 10x tampon IVT, 1 μL de mélange rNTP de 25 mM, 1 μL de vert malachite 1 mM, 2,5 μL du mélange RNAP-cage et 3 μL de gabarit d’aptamère vert malachite de 1 mM dans 15 μL de ddH2O.
    3. Configurez une réaction contenant uniquement un tampon. Mélanger 2,5 μL de 10x tampon IVT, 1 μL de mélange rNTP de 25 mM, 1 μL de vert malachite 1 mM et 3 μL de 1 mM de gabarit d’aptamère vert malachite dans 17,5 μL de ddH2O.
      NOTE : Le tableau 18 contient une référence générale pour les réactions de transcription in vitro.
  4. Transférer chaque réaction sur une plaque de 384 puits. Surveiller la transcription de l’aptamère vert malachite sur un lecteur de plaque de fluorescence pendant 2 h à 37 °C et avec une excitation de 610 nm et une émission de 655 nm. Une fois terminé, gardez la plaque sur la glace jusqu’à ce que nécessaire.
  5. Tampon micro-ondes 0,5x TBE pendant 2 min 30 s ou jusqu’à ~70 °C. Faites fonctionner les produits d’ARN de chaque puits dans un gel de polyacrylamide TBE-urée dénaturant à 12% dans le tampon chauffé 0,5x TBE à 280 V pendant 20 min, ou jusqu’à ce que le front de teinture atteigne la fin. Tacher le gel avec une coloration d’acide nucléique de colorant cyanine pendant 10 minutes sur un agitateur orbital avant l’imagerie.
    NOTE: Le tableau 19 contient la formule de réaction pour un gel dénaturant 12% TBE-Urea PAGE.

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Representative Results

Figure 5
Figure 5: Analyse SDS-PAGE de l’expression snap T7 RNAP et du test de transcription in vitro. (A) Analyse de purification de la protéine SNAP T7 RNAP, poids moléculaire SNAP T7 RNAP: 119.4kDa. FT = écoulement à partir de la colonne, W1 = fractions d’élution du tampon de lavage contenant des impuretés, E1-3 = fractions d’élution contenant un produit purifié et DE = 10x élution totale dessalée diluée. Gel protéique Bis-Tris préfabriqué à 4-12%, coloration: bleu de Coomassie, tampon de fonctionnement: tampon MES, conditions: 200 V pendant 35 min. (B) Un test de transcription in vitro a été effectué sur la protéine SNAP T7 RNAP en mesurant la production d’un aptamère fluorescent au fil du temps. La cinétique de transcription a été surveillée sur un lecteur de plaque de fluorescence pendant 2 h à des intervalles de 2 minutes à 37 °C en utilisant la longueur d’onde d’excitation à 470 nm et la longueur d’onde d’émission à 512 nm. Abréviations : RNAP = ARN polymérase ; MES = acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’expression et la purification réussies de la protéine RECOMBINANTE SNAP T7 RNAP ont été confirmées à l’aide de SDS-PAGE (Figure 5A). La bande pour SNAP T7 RNAP est attendue à environ 119 kDa, ce qui correspond aux poids moléculaires du RNAP T7 de type sauvage et de l’étiquette SNAP étant respectivement de 99 kDa et 20 kDa. La procédure de purification His-tag décrite ici a produit un total de sept fractions, composées d’une fraction d’écoulement (FT), de trois fractions de lavage (W1, W2 et W3) et de trois fractions d’élution (E1, E2 et E3). En outre, une aliquote de la protéine après échange tampon et concentration ascendante (DE) est également généralement incluse. Comme le montre la figure 5A,la bande la plus proéminente est apparue à environ 119 kDa dans les fractions d’élution, suggérant une expression protéique réussie. La majorité des fractions d’écoulement et de lavage contenaient des lysats cellulaires bruts. Une partie mineure des lysats cellulaires est transférée aux fractions d’élution, ce qui suggère que des lavages plus stricts devaient être effectués, bien que cela puisse réduire le rendement du produit protéique. En plus de la bande principale SNAP T7 RNAP, une deuxième bande moins proéminente a été observée à environ 20 kDa, ce qui a été attribué à la protéine SNAP-tag tronquée. Sur la base de l’intensité de la bande, ce sous-produit était significativement plus faible en concentration par rapport au SNAP T7 RNAP. Il peut être éliminé par un cycle supplémentaire de chromatographie ou de diafiltration d’exclusion de taille avec des filtres de coupure de poids moléculaire de 100 kDa. Suite à SDS-PAGE, l’activité enzymatique a été validée à l’aide d’une réaction de transcription in vitro (Figure 5B). Un gabarit d’ADN T7 codant pour un aptamère d’ARN fluorescent (par exemple, malachite vert26) a été utilisé, ce qui permet de surveiller la cinétique de production d’ARN à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence, ainsi que la comparaison de la cinétique de transcription entre différents lots ou conceptions de polymérases.

Figure 6
Figure 6: Analyse PAGE de la conjugaison et de la purification des BG-oligonucléotides. BG a été conjugué à l’extrémité 3' de l’oligonucléotide par chimie amine standard. Les conjugués oligonucléotidiques fonctionnalisés BG ont été purifiés à partir de sous-produits en excès à l’aide d’une colonne de spin de chromatographie d’exclusion de taille et analysés sur une PAGE TBE-Urée dénaturante à 18% après coloration d’acide nucléique de colorant cyanine. Une échelle d’ADN ultra-basse gamme a été utilisée dans ce gel. S1 = oligonucléotide, S2 = bg-oligo pré-purification, S3 = BG-oligo post-purification. Abréviations : PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide; BG = benzylguanine; TBE = Tris-borate-EDTA; EDTA = acide éthylènediamine tétraacétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les oligonucléotides fonctionnalisés par BG ont été préparés à l’aide de la chimie de réticulation réactive aux amines standard (c.-à-d. les esters BG-GLA-NHS faisant réagir avec des oligonucléotides modifiés par les amines). Le couplage réussi a été vérifié via 18% de dénaturation TBE-Urée PAGE (Figure 6). Par rapport à l’oligonucléotide non modifié (S1), l’ajout de la fraction BG à l’oligonucléotide augmente son poids moléculaire et fait que l’oligo modifié par BG (S3) se déplace plus lentement dans le gel. L’utilisation d’un gel dénaturant à pourcentage élevé est nécessaire pour observer cette différence mononucléotidique. L’analyse PAGE dénaturante est également utile pour caractériser la variabilité d’un lot à l’autre de l’efficacité de la conjugaison, car les oligonucléotides conjugués et non conjugués peuvent être résolus en tant que bandes séparées sur le gel. Si le produit contient une quantité importante d’oligonucléotides non conjugués, une deuxième série de couplages chimiques peut être appliquée pour conduire la réaction à son achèvement.

Figure 7
Figure 7: Analyse SDS-PAGE de la conjugaison et de la purification des oligonucléotides RNAP-T7. Un oligonucléotide modifié par BG est conjugué à un RNAP T7 via SNAP-tag. Les conjugués ont été purifiés de l’excès d’oligonucléotides à l’aide de fortes colonnes de spin d’échange de cations, avant d’être analysés par SDS-PAGE coloré avec à la fois(A)une coloration d’acide nucléique de colorant cyanine et(B)une coloration bleu de Coomassie. Une échelle protéique et une échelle d’ADN de 10 bp ont été utilisées dans ce gel. FT = écoulement à partir de la colonne, W1-W3 = fractions d’élution du tampon de purification contenant des impuretés, E = fractions d’élution groupées contenant un produit purifié, P = produit purifié après échange de tampon de filtration et concentration ascendante, C = SNAP T7 RNAP uniquement comme témoin. Cette figure a été modifiée à partir de Chou et Shih27. Abréviations : RNAP = ARN polymérase ; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Après la production du SNAP T7 RNAP et de l’oligonucléotide modifié par BG, la synthèse du RNAP attaché à l’ADN a été une simple réaction de mélange à un pot. Le RNAP T7 attaché à l’ADN qui en résulte a été purifié de l’excès d’oligonucléotides BG à l’aide d’une forte colonne de spin d’échange de cations et analysé en dénaturant SDS-PAGE (Figure 7). Comme pour le schéma de purification His-tag décrit dans un paragraphe précédent, un total de sept fractions ont été analysées, y compris le débit initial (FT), trois fractions de lavage (W1 à W3), les fractions d’élution groupées (E), le produit concentré vers le haut (P) et un contrôle contenant du RNAP T7 non conjugué (C). Pour vérifier la conjugaison réussie, le gel a d’abord été coloré avec un colorant cyanine pour l’acide nucléique, suivi du bleu de Coomassie pour la protéine. Comme on peut l’observer dans le gel coloré à la cyanine(figure 7A),le FT initial contenait principalement un excès d’oligonucléotide BG, ainsi qu’une petite partie de la polymérase attachée à l’ADN (c’est-à-dire l’oligo-ARNP) qui ne se liait pas à la résine échangeuse de cations.

Les fractions de lavage contenaient une série de bandes plus faibles des oligonucléotides BG (W1-W3) au fond du gel. Cela suggère une élimination réussie de l’excès d’oligonucléotide. Les fractions d’élution groupées (E) ne contenaient que la bande unique d’ARNR-oligo causée par la liaison du colorant cyanine à l’attache oligonucléotidique. Si la voie E contient des bandes d’oligonucléotides libres, d’autres étapes de lavage peuvent être nécessaires pour les retirer de l’échantillon. La voie contenant le produit filtré et concentré vers le haut (P) présentait la même bande que E, mais beaucoup plus sombre, ce qui signifie que la procédure de concentration ascendante a réussi. La colonne de contrôle des protéines ne contenait que des protéines, qui présentaient une liaison non spécifique minimale au colorant cyanine, considérée comme une bande faible. Les mêmes tendances ont été observées dans le gel taché de bleu de Coomassie(figure 7B). Un petit changement de mobilité du gel a été observé lors de la comparaison de l’ARNR conjugué aux oligonucléotides au contrôle de l’ARNP non conjugué.

Figure 8
Figure 8: Essai de transcription in vitro des états ON et OFF du système de polymérase en cage. (A) Schéma illustrant l’ARNP T7 dans des états en cage et non en cage. (B et C) Un test de transcription in vitro a été effectué sur les états en cage et non câpés de la polymérase en mesurant la production d’un aptamère fluorescent. Cette figure montre une augmentation de 336 fois du taux de transcription entre les états ON et OFF. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (n = 3). Cette figure a été modifiée à partir de Chou et Shih27. Abréviations : RNAP = ARN polymérase ; TF = facteur de transcription. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour démontrer une méthode de commutation à la demande de la capacité transcriptionnelle dans le système d’ARN polymérase attachée, une conception de modèle d’ADN répondant à une paire de brins d’entrée d’acide nucléique TFA et TFB a été utilisée (Figure 8A). L’activité transcriptionnelle a été surveillée en mesurant la production de l’aptamère fluorescent vert malachite dans les états OFF (c.-à-d. cage) et ON (c.-à-d. non en cage). La quantité de signal de fluorescence produite à la fin de la transcription in vitro est montrée à la figure 8B, et la cinétique en temps réel est montrée à la figure 8C. Ici, une activation de 336 fois dans le signal de fluorescence peut être observée, démontrant un contrôle robuste de l’activité de la polymérase.

Réactif Concentration initiale Unités Volume Unités Concentration finale Unités
Tris 1 M 1.5 Ml 50 mm
NaCl 5 M 1.8 Ml 300 mm
Glycérol 100 % 1.5 Ml 5 %
BME 14.2 M 10.5 μL 5 mm
ddH2O -- -- 25.2 Ml -- --
Volume final -- -- 30 Ml -- --

Tableau 1 : Formule tampon de lyse/équilibrage.

Réactif Concentration initiale Unités Volume Unités Concentration finale Unités
Tris 1 M 1.5 Ml 50 mm
NaCl 5 M 4.8 Ml 800 mm
Glycérol 100 % 1.5 Ml 5 %
BME 14.2 M 7.0 μL 5 mm
Imidazole 2 M 200 μL 20 mm
ddH2O -- -- 22.2 Ml -- --
Volume final -- -- 30 Ml -- --

Tableau 2 : Formule tampon de lavage.

Réactif Concentration initiale Unités Volume Unités Concentration finale Unités
Tris 1 M 0.5 Ml 50 mm
NaCl 5 M 1.6 Ml 800 mm
Glycérol 100 % 0.5 Ml 5 %
BME 14.2 M 3.5 μL 5 mm
Imidazole 2 M 1 Ml 200 mm
ddH2O -- -- 6.4 Ml -- --
Volume final -- -- 10 Ml -- --

Tableau 3 : Formule tampon d’élution.

Réactif Concentration initiale Unités Volume Unités Concentration finale Unités
Tris 1 M 5 Ml 100 mm
NaCl 5 M 2 Ml 200 mm
BME 14.2 M 140.8 μL 40 mm
Triton X-100 100 % 100 μL 0.2 %
EDTA 0.5 M 200 μL 2 mm
ddH2O -- -- 42.56 Ml -- --
Volume final -- -- 50 Ml -- --

Tableau 4 : Formule de tampon de stockage.

Échantillon Description μL de l’échantillon μL de colorant de chargement
1 Échelle des protéines 9 --
2 FT : Écoulement 9 3
3 W1: Lavage 1 9 3
4 W2: Lavage 2 9 3
5 W3: Lavage 3 9 3
6 E1 : Élution 1 9 3
7 E2 : Élution 2 9 3
8 E3 : Élution 3 9 3
9 DE: Élution dessalée 9 3

Tableau 5 : Chargement d’échantillons SDS-PAGE pour les voies de gauche à droite.

Réactif Concentration initiale Unités Concentration finale Unités Volume final Unités
Tampon de transcription 10 X 1 X 2 μL
Mélange rNTP 25 mm 0.5 mm 0.4 μL
Modèle d’ADN 500 Nm 125 Nm 5 μL
SNAP T7 RNAP 500 Nm 50 Nm 2 μL
Eau sans nucléase -- -- -- -- 10.6 μL
Volume total 20 μL

Tableau 6 : Formule de réaction de transcription in vitro avec SNAP T7 RNAP (mélange maître).

Réactif Concentration initiale Unités Concentration finale Unités Volume final Unités
Tampon de transcription 10 X 1 X 2 μL
Mélange rNTP 25 mm 0.5 mm 0.4 μL
Modèle d’ADN 500 Nm 125 Nm 5 μL
WT T7 RNAP 500 Nm 50 Nm 2 μL
Eau sans nucléase -- -- -- -- 10.6 μL
Volume total 20 μL

Tableau 7 : Formule de réaction de transcription in vitro avec RNAP T7 de type sauvage (WT) (mélange maître).

Réactif Concentration initiale Unités Concentration finale Unités Volume final Unités
Tampon de transcription 10 X 1 X 2 μL
Mélange rNTP 25 mm 0.5 mm 0.4 μL
Modèle d’ADN 500 Nm 125 Nm 5 μL
Eau sans nucléase -- -- -- -- 12.6 μL
Volume total 20 μL

Tableau 8 : Formule de réaction de transcription in vitro sans polymérase; contrôle de tampon uniquement.

Réactif Concentration initiale Unités Volume Unités Final Unités Final Unités Volume final Unités
NaHCO3 1 M 25 μL 0.05 mm 1.25E-05 Mol 500 μL
DMSO 100 % 284 μL 56.8 % --- --- 500 μL
Oligo 1 mm 125 μL 0.25 μM 6.25E-08 Mol 500 μL
BG-GLA-NHS dans DMSO 50 mm 66 μL 6.6 mm 1.65E-06 Mol 500 μL

Tableau 9 : Formule réactionnelle pour la conjugaison de la benzylguanine à l’oligonucléotide.

Volume de gel 10 mL
Concentration d’acrylamide 18%
g URÉE 4.8
mL d’acrylamide à 40 % (19:1) 4.5
mL de 10x TBE 1
mL de ddH2O 2.8
μL de TEMED 5
μL de 10 % APS 100

Tableau 10 : Formule de réaction pour une PAGE dénaturant l’URÉE-TBE à 18%.

Échantillon Description Échantillon μl μl colorant de charge
1 L: Échelle ultra-basse portée 3 --
2 S1 : oligo de 100 nM 3 3
3 S2 : 100 nM oligo-BG 3 3
4 S3 : 100 nM oligo-BG + Centri-Spin 3 3

Tableau 11 : Dénaturation du chargement d’échantillons PAGE pour les voies de gauche à droite.

Échantillon Concentration (M) oligo:RNAP
1 2.50E-04 5:1
2 2.00E-04 4:1
3 1.50E-04 3:1
4 1.00E-04 2:1
5 5.00E-05 1:1
6 2.50E-05 1:2
7 1.68E-05 1:3
8 1.25E-05 1:4
9 1.00E-06 1:5

Tableau 12 : Rapports de réactif pour le couplage à l’échelle analytique de l’oligonucléotide BG à l’ARNP SNAP T7.

Réactif Volume Unité
Tampon SNAP 2 μL
BG-Oligo 4 μL
SNAP-T7 RNAP 4 μL
Volume total 10 μL

Tableau 13 : Formule de réaction pour la réaction d’étiquetage de l’étiquette SNAP.

Pelouse Description de l’exemple Volume de l’échantillon (μL) Volume tampon SNAP (μL) Volume de colorant de chargement (μL)
1 Exemple 1 2 4 2
2 Exemple 2 2 4 2
3 Exemple 3 2 4 2
4 Exemple 4 2 4 2
5 Exemple 5 2 4 2
6 Exemple 6 2 4 2
7 Exemple 7 2 4 2
8 Exemple 8 2 4 2
9 Exemple 9 2 4 2
10 Contrôle RNAP 2 4 2
11 Contrôle oligo 2 4 2
12 Échelle 4 -

Tableau 14 : Formules de réaction Bis-Tris PAGE (4%-12%) pour les échantillons de chargement de voie de gel.

Réactif Concentration initiale Unités Volume Unités Concentration finale Unités Volume final Unités
Tris 1 M 50 μL 50 mm 1000 μL
NaCl 5 M 100 μL 0.5 M 1000 μL
ddH2O -- -- 850 μL -- -- 1000 μL

Tableau 15 : Formule de réaction pour le tampon d’élution (11.1).

Réactif Concentration initiale Unités Concentration finale Unités volume à pipette Unités
Tris 1000 mm 25 mm 25 μL
EDTA 500 mm 5 mm 10 μL
MgCl 1000 mm 25 mm 25 μL
ddH2O -- -- -- -- 940 μL

Tableau 16 : Formule de réaction pour 5x tampon de recuit.

Réactif Concentration initiale Unités Concentration finale Unités Volume à pipette Unités Volume total de réaction Unités
tampon de recuit 5 X 1 X 5 μL 24 μL
sens 10 μM 1 μM 2.4 μL 24 μL
antisens 10 μM 1 μM 2.4 μL 24 μL
ddH2O -- -- -- -- 14.2 μL 24 μL

Tableau 17 : Formule de réaction utilisée pour recuit deux modèles d’ADNS (brins sens et antisens).

Réactif Concentration initiale Unités Concentration finale Unités Volume à pipette Unités Volume total de réaction Unités
Tampon de transcription in vitro (IVT) 10 X 1 X 2.5 μL 25 μL
Mélange rNTP 25 mm 1 mm 1 μL 25 μL
Vert Malachite 1 mm 40 μM 1 μL 25 μL
RNAP 500 Nm 50 Nm 2.5 μL 25 μL
Modèle d’ADN 1000 Nm 120 Nm 3 μL 25 μL
ddH2O -- -- -- -- 14 μL 25 μL

Tableau 18 : Formule de réaction de transcription in vitro (mélange maître); comprend la concentration de RNAP.

Gel Volume 10 mL
Concentration d’acrylamide 12%
g URÉE 4.8
ml 40% d’acrylamide (29:1) 3
ml 10x TBE 1
ml ddH2O 4.3
μl TEMED 5
μl 10 % APS 100

Tableau 19 : Formule de réaction pour une PAGE dénaturante tbe-urée à 12%.

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Discussion

Cette étude démontre une approche inspirée de la nanotechnologie de l’ADN pour contrôler l’activité de l’ARN polymérase T7 en couplant de manière covalente un RNAP T7 recombinant marqué N-terminal SNAP avec un oligonucléotide fonctionnalisé BG, qui a ensuite été utilisé pour programmer les réactions TMDSD. De par sa conception, la balise SNAP a été positionnée à la terminaison N de la polymérase, car la terminaison C de l’ARNR T7 de type sauvage est enfouie dans le noyau de la structure protéique et établit des contacts importants avec le modèle d’ADN28. Des tentatives antérieures de modification de la terminaison C de la polymérase ont entraîné une perte complète de l’activité enzymatique à moins que d’autres mutations compensatoires ne soient introduites. 29,30 En revanche, les fusions N-terminales du RNAP T7 sont bien tolérées, bien que le choix de l’étiquette de fusion puisse affecter l’activité de la polymérase. La façon dont les différentes balises affectent l’activité RNAP n’a pas été systématiquement déterminée. La balise SNAP a été choisie parce qu’elle est efficace et robuste, permettant un marquage quantitatif des rapports stœchiométriques de la protéine et de l’oligonucléotide. Alternativement, d’autres chimies de couplage peuvent être utilisées pour lier l’oligonucléotide à la polymérase, telles que les étiquettes Ybbr31, les étiquettes Sortase32et SpyTags33, ou bien via l’introduction d’acides aminés non naturels portant des groupes réactifs. La différence de taille et de séquence entre ces étiquettes peut également affecter l’activité de la protéine de fusion résultante, et le choix optimal pour le marquage RNAP spécifique au site mérite une étude future. Enfin, il est recommandé de limiter la longueur de l’oligonucléotide attaché à l’ARNP à < 30 nt. Ceci est conçu pour réduire les interactions électrostatiques non spécifiques entre l’oligonucléotide et le domaine de liaison à l’ADN de l’ARNP T7 et pour faciliter la purification de l’ADNR attaché à l’oligonucléotide par chromatographie par échange d’ions.

La technologie proposée décrite ici nécessite l’expression d’un RNAP SNAP T7 recombinant, et il y a deux étapes critiques au cours du processus de synthèse qui affectent le rendement global du produit protéique. Tout d’abord, l’utilisation de la sonication pour la lyse cellulaire peut chauffer l’échantillon (section 4). Pour assurer une lyse cellulaire et une extraction des protéines efficaces sans dénaturer thermiquement la protéine, l’échantillon cellulaire doit être conservé sur la glace tout au long de la sonication et la température de la sonde de sonication doit être surveillée entre chaque échantillon. Une deuxième étape critique est l’échange de tampon et la concentration ascendante du SNAP T7 RNAP après la purification de His-tag (étape 4.11.2). Il est important de laver doucement la membrane de l’unité de filtration centrifuge pour empêcher l’agrégation des protéines, ce qui diminuerait le rendement global et la fonctionnalité des protéines.

En principe, la réaction BG-oligonucléotide avec SNAP-tag est quantitative à un rapport molaire de 1:1. Cependant, une gamme de rapports stœchiométriques oligonucléotides-polymérases doit être testée avant de préparer un plus grand lot du matériau. En effet, les estimations de la concentration en protéines peuvent être inexactes. Cette étape peut nécessiter d’effectuer SDS-PAGE de la réaction de couplage à différentes dilutions de l’oligonucléotide BG par rapport à une concentration protéique constante afin d’identifier le rapport de couplage optimal. Lors de l’analyse PAGE, le même gel peut être coloré en série avec deux taches: une coloration d’acide nucléique suivie d’une coloration protéique Coomassie Blue. Il est important de bien laver le SDS du gel avant de le tacher avec la tache d’acide nucléique. En effet, le SDS va piéger le colorant dans le gel, conduisant à un signal de fond élevé. De plus, la coloration de l’acide nucléique doit être effectuée avant la coloration de la protéine Coomassie Blue.

Bien que ce système proposé combine l’évolutivité d’un circuit d’ADN avec la fonctionnalité d’un circuit transcriptionnel à base de protéines, il introduit également des limitations observées dans les circuits transcriptionnels. L’un des nombreux avantages des ordinateurs à ADN est la stabilité des acides nucléiques dans une variété d’environnements. Avec l’ajout de polymérases, le système de polymérase attachée doit être stocké dans des conditions spécifiques pour éviter la dénaturation. De plus, le calcul doit se produire dans un environnement avec des conditions tampons spécifiques qui permettent la transcription. Bien que l’ARN polymérase du bactériophage T7 soit utilisée dans cette démonstration, une autre ARN polymérase avec des conditions plus appropriées à l’application peut être utilisée pour contourner cette limitation.

Les résultats montrent que ce système de polymérase attachée peut être basculé entre les états OFF (par exemple, en cage) et ON (c’est-à-dire sans cage) en utilisant des « facteurs de transcription » d’acides nucléiques. L’utilisation de l’ADN pour réguler la transcription permet de concevoir des circuits transcriptionnels à grande échelle, y compris la construction de cascades de signaux multicouches et de rétroaction. Une autre caractéristique est l’auto-amplification des signaux d’entrée reçus ou passés à travers le circuit, car une polymérase activée qui s’est hybridée à un modèle continuera à produire plus de copies de sa transcription jusqu’à ce qu’elle soit arrêtée. Ce mécanisme d’amplification du signal peut être exploité pour amplifier la réponse du circuit aux entrées à faible concentration. Enfin, ce bloc de construction peut être utilisé pour implémenter une gamme de logiques numériques. Cette étude démontre l’activation des modèles via « ET logique » en concevant des modèles qui doivent être activés par deux brins d’acide nucléique. De même, la « logique OR » peut être conçue en rendant un modèle d’ADN réactif uniquement au brin B et en introduisant un intermédiaire « adaptateur » qui séquestre le brin A en échange de la production d’une autre copie du brin B. Dans ce cas, l’introduction du brin A ou B en tant qu’entrées dans la réaction déclencherait la transcription du modèle d’ADN cible. La capacité de concevoir rationnellement une variété de comportements de circuits à grande échelle devrait permettre la mise en œuvre d’algorithmes de calcul moléculaire complexes pour des applications émergentes dans la détection de maladies, la biofabrication portable, ainsi que le traitement et le stockage de données moléculaires.

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Disclosures

Il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents à déclarer par l’un des auteurs.

Acknowledgments

L.Y.T.C reconnaît le généreux soutien du Fonds-exploration Nouvelles frontières en recherche (NFRF-E), de la subvention de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et de l’initiative Medicine by Design de l’Université de Toronto, qui reçoit un financement du Fonds d’excellence en recherche Canada First (CFREF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) BioShop TWN510.5
0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio Basic SD8135
10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) Bio Basic PD0435 Tablets used to make 10 mM buffer
10% ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich A3678-100G
100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC910008
100% acetone Fisher Chemical A18P4
100% ethanol (EtOH) House Brand 39752-P016-EAAN
10x in vitro transcription (IVT) buffer New England Biolabs B9012
10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Bio Basic A0026
1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I5502-1G
1M sodium bicarbonate buffer Sigma Aldrich S6014-500G
1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma Aldrich 648311-1KG
1X Tris-EDTA (TE) buffer ThermoFisher 12090015
2M imidazole Sigma Aldrich 56750-100G
2-mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich M3148
3M sodium acetate Bio Basic SRB1611
40% acrylamide (19:1) Bio Basic A00062
4x LDS protein sample loading buffer Fisher Scientific NP0007
5M sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
5mM dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 43815-1G
6x gel loading dye New England Biolabs B7024S
agarose B powder Bio Basic AB0014
BG-GLA-NHS New England Biolabs S9151S
BL21 competent E. coli Addgene C2530H
BLUeye prestained protein ladder FroggaBio PM007-0500
bromophenol blue Bio Basic BDB0001
coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) ThermoFisher LC6060
cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) Fisher Scientific S11494
cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) Fisher Scientific S33102
dry dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D12345
formamide Sigma Aldrich F9037-100ML
glycerol Bio Basic GB0232
kanamycin sulfate BioShop KAN201.5
lysogeny broth Sigma Aldrich L2542-500ML
malachite green oxalate Sigma Aldrich 2437-29-8
N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Sigma Aldrich T9281-25ML
NuPAGE MES SDS running buffer (20x) Fisher Scientific LSNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well Life Technologies NP0322BOX
oligonucleotide (cage antisense) IDT N/A TATAGTGAGTCGTATTAATTTG
oligonucleotide (cage sense) IDT N/A TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA
TTAATACGACTCACTATA
oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) IDT N/A GGATCCATTCGTTACCTGGCT
CTCGCCAGTCGGGATCCTATA
GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT
TATCGCCGTAGTTGGTGTACT
oligonucleotide (malachite green aptamer sense) IDT N/A TAATACGACTCACTATAGGATC
CCGACTGGCGAGAGCCAGGT
AACGAATGGATCC
oligonucleotide (Transcription Factor A) IDT N/A AGTACACCAACTACGAGTGAG
oligonucleotide (Transcription Factor B) IDT N/A TCAGTCACCTATCTGGCGATAA
TGGAACTG
oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) IDT N/A GCTACTCACTCAGATAGGTGAC
TGA/3AmMO/
Pierce strong ion exchange spin columns Fisher Scientific 90008
plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes Genscript N/A custom gene insert
protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) Fisher Scientific 88226
rNTP mix New England Biolabs N0466S
Roche mini quick DNA spin column Sigma Aldrich 11814419001
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML
Ultra Low Range DNA ladder Fisher Scientific 10597012
urea BioShop URE001.1

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