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Bioengineering

प्रोग्रामेबल इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और मॉलिक्यूलर कंप्यूटेशन के लिए डीएनए-टेथर्ड आरएनए पॉलीमरेज

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/62073
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto

Summary

हम इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए एक उपन्यास डीएनए-सीमित T7 आरएनए पॉलीमरेज की इंजीनियरिंग का वर्णन करते हैं। हम प्रोटीन संश्लेषण और लक्षण वर्णन के लिए कदमों पर चर्चा करते हैं, प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट ट्रांसक्रिप्शनल नियमन को मान्य करते हैं, और आणविक कंप्यूटिंग, निदान और आणविक सूचना प्रसंस्करण में इसके अनुप्रयोगों पर चर्चा करते हैं।

Abstract

डीएनए नैनो प्रोग्राम करने योग्य आत्म-नाभिक एसिड की असेंबली को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयोगकर्ता-निर्धारित आकार और गतिशीलता में सक्षम बनाता है। यह काम दर्शाता है कि डीएनए नैनो से अवधारणाओं को फेज-व्युत्पन्न T7 आरएनए पॉलीमरेज (आरएनएपी) की एंजाइमेटिक गतिविधि को प्रोग्राम करने और स्केलेबल सिंथेटिक जीन नियामक नेटवर्क बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे पहले, एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड-टेथेर टी 7 आरएनएपी को एन-मरणासन्न स्नैप-टैग आरएनएपी की अभिव्यक्ति और बाद में एक बेंजिल्गुएनिन (बीजी)-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ स्नैप-टैग के रासायनिक युग्मन की अभिव्यक्ति के माध्यम से इंजीनियर किया जाता है। इसके बाद, न्यूक्लिक-एसिड स्ट्रैंड विस्थापन का उपयोग मांग पर पॉलीमरेज ट्रांसक्रिप्शन को प्रोग्राम करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, सहायक न्यूक्लिक एसिड असेंबली का उपयोग डीएनए-प्रोग्राम किए गए T7 आरएनएपी के बीच बातचीत को अपने डीएनए टेम्पलेट्स के साथ विनियमित करने के लिए "कृत्रिम प्रतिलेखन कारक" के रूप में किया जा सकता है। यह इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन नियामक तंत्र विभिन्न प्रकार के सर्किट व्यवहार जैसे डिजिटल तर्क, प्रतिक्रिया, कैस्केडिंग और मल्टीप्लेक्सिंग को लागू कर सकता है। इस जीन नियामक वास्तुकला की रचना डिजाइन अमूर्तता, मानकीकरण और स्केलिंग की सुविधा प्रदान करती है। इन सुविधाओं से बायो सेंसिंग, डिजीज डिटेक्शन और डाटा स्टोरेज जैसे एप्लीकेशंस के लिए इन विट्रो जेनेटिक डिवाइसेज की तेजी से प्रोटोटाइप हो सकेगी ।

Introduction

डीएनए कंप्यूटिंग गणना के माध्यम के रूप में डिजाइन ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के एक सेट का उपयोग करता है। इन ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट तर्क के अनुसार गतिशील रूप से इकट्ठा करने और विशिष्ट न्यूक्लिक-एसिड इनपुट का जवाब देने के लिए दृश्यों के साथ प्रोग्राम किया जाता है। प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययनों में, गणना के उत्पादन में आम तौर पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड का एक सेट होता है जिसे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस या फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर्स के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। पिछले 30 वर्षों में, तेजी से जटिल डीएनए कंप्यूटेशनल सर्किटरी का प्रदर्शन किया गया है, जैसे विभिन्न डिजिटल तर्क झरना, रासायनिक प्रतिक्रिया नेटवर्क, और तंत्रिका नेटवर्क1,2,3। इन डीएनए सर्किट की तैयारी के साथ सहायता करने के लिए, गणितीय मॉडल सिंथेटिक जीन सर्किट4, 5की कार्यक्षमता की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और कम्प्यूटेशनल उपकरण ऑर्थोगोनल डीएनए अनुक्रम डिजाइन6,7,8,9,10 के लिए विकसित किया गया है . सिलिकॉन आधारित कंप्यूटरों की तुलना में, डीएनए कंप्यूटर के फायदों में बायोमॉलिक्यूल्स के साथ सीधे इंटरफेस करने की उनकी क्षमता शामिल है, बिजली की आपूर्ति के अभाव में समाधान में काम करते हैं, साथ ही उनकी समग्र कॉम्पैक्टनेस और स्थिरता भी शामिल है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन के साथ, डीएनए कंप्यूटर संश्लेषण की लागत पिछले दो दशकों से मूर के कानून11की तुलना में तेजी से एक दर पर कम हो रही है । ऐसे डीएनए आधारित कंप्यूटरों के अनुप्रयोग अब उभरने लगे हैं, जैसे रोग निदान12,13,आणविक जैव भौतिकी 14 को शक्ति देने के लिए और डेटा भंडारण प्लेटफार्म15के रूप में ।

Figure 1
चित्रा 1:टोहोल्ड-मध्यस्थता डीएनए स्ट्रैंड विस्थापन का तंत्र। δ, टोहोल्ड, आंशिक डुप्लेक्स पर एक स्वतंत्र, अनबाउंड अनुक्रम है। जब एक पूरक डोमेन (δ *) एक दूसरे कतरा पर शुरू किया जाता है, मुक्त δ डोमेन संकरण के लिए एक toehold के रूप में कार्य करता है, कतरा के बाकी के लिए अनुमति देता है (ɑ *) धीरे से एक ज़िपिंग के माध्यम से अपने प्रतियोगी विस्थापित/ जैसे-जैसे δ की लंबाई बढ़ती है, आगे की प्रतिक्रिया के लिए एजीजी कम हो जाता है, और विस्थापन अधिक आसानी से होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आज तक, अधिकांश डीएनए कंप्यूटर गतिशील डीएनए नैनो के क्षेत्र में एक अच्छी तरह से स्थापित आकृति का उपयोग करते हैं जिसे टोहोल्ड-मध्यस्थता डीएनए स्ट्रैंड विस्थापन (टीएमडीएसडी, चित्रा 1) 16के रूप में जानाजाताहै। इस आकृति में आंशिक रूप से डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) डुप्लेक्स होते हैं जो छोटे "टोहोल्ड" ओवरहांग (यानी, 7-से 10 न्यूक्लियोटिड्स (एनटी)) प्रदर्शित करते हैं। न्यूक्लिक एसिड "इनपुट" किस्में टोहोल्ड के माध्यम से आंशिक डुप्लेक्स के साथ बातचीत कर सकती हैं। यह आंशिक डुप्लेक्स से एक किस्में के विस्थापन की ओर जाता है, और यह मुक्त कतरा फिर डाउनस्ट्रीम आंशिक डुप्लेक्स के लिए इनपुट के रूप में काम कर सकता है। इस प्रकार, टीएमडीएसडी सिग्नल कैस्केडिंग और सूचना प्रसंस्करण को सक्षम बनाता है। सिद्धांत रूप में, ऑर्थोगोनल टीएमडीएसडी रूपांकनों समाधान में स्वतंत्र रूप से काम कर सकते हैं, समानांतर सूचना प्रसंस्करण को सक्षम करते हैं। टीएमडीएसडी प्रतिक्रिया पर कई भिन्नताएं रही हैं, जैसे टोहोल्ड-मध्यस्थता डीएनए स्ट्रैंड एक्सचेंज(टीएमडीएसई) 17,डबल-लॉन्ग डोमेन18,अनुक्रम-बेमेल टोहोल्ड19,और "हैंडहोल्ड"-मध्यस्थता वाले फंसे विस्थापन20के साथ "लीकरहित" टोहोल्ड। ये अभिनव डिजाइन सिद्धांत डीएनए कंप्यूटिंग प्रदर्शन में सुधार के लिए अधिक पतले देखते टीएमडीडी एनर्जेस और गतिशीलता की अनुमति देते हैं।

ट्रांसक्रिप्शनल जीन सर्किट जैसे सिंथेटिक जीन सर्किट भी गणना21, 22,23में सक्षम हैं। इन सर्किटों को प्रोटीन ट्रांसक्रिप्शन कारकों द्वारा विनियमित किया जाता है, जो विशिष्ट नियामक डीएनए तत्वों के लिए बाध्यकारी द्वारा जीन के प्रतिलेखन को सक्रिय या दबाते हैं। डीएनए आधारित सर्किट की तुलना में, ट्रांसक्रिप्शनल सर्किट के कई फायदे हैं। सबसे पहले, एंजाइमेटिक ट्रांसक्रिप्शन में मौजूदा उत्प्रेरक डीएनए सर्किट की तुलना में बहुत अधिक टर्नओवर दर है, इस प्रकार इनपुट की एक प्रति प्रति आउटपुट की अधिक प्रतियां पैदा होती हैं और सिग्नल प्रवर्धन का अधिक कुशल साधन प्रदान करती हैं। इसके अलावा, ट्रांसक्रिप्शनल सर्किट विभिन्न कार्यात्मक अणुओं का उत्पादन कर सकते हैं, जैसे कि एप्टामर्स या मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) चिकित्सीय प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग, कंप्यूटेशन आउटपुट के रूप में, जिसका विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए शोषण किया जा सकता है। हालांकि, वर्तमान ट्रांसक्रिप्शनल सर्किट की एक प्रमुख सीमा उनकी स्केलेबिलिटी की कमी है। इसका कारण यह है कि आर्थोगोनल प्रोटीन आधारित प्रतिलेखन कारकों का एक बहुत ही सीमित सेट है, और नए प्रोटीन ट्रांसक्रिप्शन कारकों का डी नोवो डिजाइन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला रहता है।

Figure 2
चित्रा 2:अमूर्तता और "तार" और "पिंजरे" बहुलक परिसर के तंत्र । (ए और बी)एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड तार को स्नैप-टैग प्रतिक्रिया के माध्यम से T7 बहुलक के लिए लेबल किया गया है । एक टेथर-पूरक ओवरहांग के साथ "अशुद्ध" T7 प्रमोटर से मिलकर एक पिंजरे यह तार और ब्लॉक प्रतिलेखन गतिविधि को संकरित करने के लिए अनुमति देता है । (ग)जब ऑपरेटर(ए * बी *)मौजूद होता है, तो यह ओलिगोन्यूक्लियोटाइड टेथर(एबी)पर टोहोल्ड से बांधता है और पिंजरे के बी * क्षेत्र को विस्थापित करता है, जिससे प्रतिलेखन होता है । इस आंकड़े को चाउ और शिह27से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त: आरएनएपी = आरएनए पॉलीमरेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यह पेपर आणविक कंप्यूटिंग के लिए एक उपन्यास बिल्डिंग ब्लॉक का परिचय देता है जो डीएनए-आधारित सर्किट की स्केलेबिलिटी के साथ ट्रांसक्रिप्शनल सर्किट की कार्यक्षमताओं को जोड़ती है। यह बिल्डिंग ब्लॉक एक T7 RNAP सहसंयोजक रूप से एक फंसे डीएनए तार(चित्रा 2A)के साथ जुड़ा हुआ है । इस डीएनए-सीमित T7 आरएनएपी को संश्लेषित करने के लिए, पॉलीमरेज को एन-टर्मिनल स्नैप-टैग24 से जोड़ा गया था और एस्चेरिचिया कोलाईमें फिर से व्यक्त किया गया था । स्नैप-टैग को बीजी सब्सट्रेट के साथ कार्यात्मक एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की गई थी। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड टेथर डीएनए संकरण के माध्यम से पॉलीमरेज के करीब निकटता में आणविक मेहमानों की स्थिति की अनुमति देता है। ऐसा ही एक अतिथि एक प्रतिस्पर्धी ट्रांसक्रिप्शनल अवरोधक था जिसे "पिंजरे" के रूप में जाना जाता है, जिसमें एक "अशुद्ध" टी 7 प्रमोटर डीएनए डुप्लेक्स होता है जिसमें कोई जीन डाउनस्ट्रीम(चित्रा 2B) नहीं होता है। जब अपने ओलिगोन्यूक्लियोटाइड तार के माध्यम से आरएनएपी के लिए बाध्य, पिंजरे आरएनएपी बाध्यकारी के लिए अन्य डीएनए टेम्पलेट्स को मात देकर पॉलीमरेज गतिविधि करते हैं, आरएनएपी को "ऑफ" राज्य(चित्रा 2C)में प्रदान करते हैं।

एक "पर" राज्य के लिए बहुलक को सक्रिय करने के लिए, जीन के T7 प्रमोटर के ऊपर एकल फंसे "ऑपरेटर" डोमेन के साथ T7 डीएनए टेम्पलेट्स डिजाइन किए गए थे । ऑपरेटर डोमेन (यानी, डोमेन ए * बी * फिगर 2सी)को टीएमडीएसडी के माध्यम से आरएनएपी से पिंजरे को विस्थापित करने और आरएनएपी समीपस्थ को जीन के T7 प्रमोटर को स्थान देने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, इस प्रकार प्रतिलेखन शुरू किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, डीएनए टेम्पलेट्स भी डिजाइन किए गए थे जहां ऑपरेटर अनुक्रम सहायक न्यूक्लिक-एसिड किस्में के पूरक थे जिन्हें "कृत्रिम प्रतिलेखन कारक" (यानी, चित्र 3 ए में टीएफए और टीएफबी किस्में) के रूप में जाना जाता है। जब दोनों किस्में प्रतिक्रिया में पेश की जाती हैं, तो वे ऑपरेटर साइट पर इकट्ठा होंगे, एक नया छद्म-समीपस्थ डोमेन ए * बी *बना एंगे। यह डोमेन तब ट्रांसक्रिप्शन(चित्रा 3B)शुरू करने के लिए टीएमडीएसडी के माध्यम से पिंजरे को विस्थापित कर सकता है। इन किस्में या तो बहिर्जनात्मक या उत्पादित आपूर्ति की जा सकती है।

Figure 3
चित्र 3:तीन-घटक स्विच एक्टिवेटर के माध्यम से पॉलीमरेज गतिविधि की चयनात्मक प्रोग्रामिंग। (क)जब प्रतिलेखन कारक (टीएफए और टीएफबी)मौजूद होते हैं, तो वे प्रमोटर के अपस्ट्रीम ऑपरेटर डोमेन को बांधते हैं, जो टोहोल्ड मध्यस्थता डीएनए विस्थापन के माध्यम से पिंजरे को विस्थापित करने में सक्षम एक छद्म एकल-फंसे अनुक्रम(ए * बी *)बनाते हैं । (ख)यह ए * बी * डोमेन ट्रांसक्रिप्शन शुरू करने के लिए टीएमडीएसडी के माध्यम से पिंजरे को विस्थापित कर सकता है । इस आंकड़े को चाउ और शिह27से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त रूप: TF = प्रतिलेखन कारक; आरएनएपी = आरएनए पॉलीमरेज; TMDSD = toehold-मध्यस्थता डीएनए कतरा विस्थापन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के लिए न्यूक्लिक एसिड-आधारित ट्रांसक्रिप्शन कारकों का उपयोग डिजिटल तर्क, प्रतिक्रिया और सिग्नल कैस्केडिंग जैसे परिष्कृत सर्किट व्यवहारों के स्केलेबल कार्यान्वयन की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, कोई भी न्यूक्लिक एसिड दृश्यों को डिजाइन करके तर्क गेट कैस्केड का निर्माण कर सकता है जैसे कि अपस्ट्रीम जीन से ट्रांसक्रिप्ट एक डाउनस्ट्रीम जीन को सक्रिय करते हैं। इस प्रस्तावित प्रौद्योगिकी द्वारा सक्षम कैस्केडिंग और मल्टीप्लेक्सिंग का शोषण करने वाला एक अनुप्रयोग पोर्टेबल निदान और आणविक डेटा प्रसंस्करण के लिए अधिक परिष्कृत आणविक कंप्यूटिंग सर्किटरी का विकास है। इसके अलावा, आणविक कंप्यूटिंग और डी नोवो आरएनए संश्लेषण क्षमताओं को एकीकृत करने से नए अनुप्रयोगों को सक्षम किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक आणविक सर्किट को उपयोगकर्ता-परिभाषित आरएनए के संयोजन का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है और चिकित्सीय आरएनए या एमआरएएनए एन्कोडिंग कार्यात्मक पेप्टाइड्स या प्रोटीन को पॉइंट-ऑफ-केयर चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए आउटपुट कर सकते हैं।

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Protocol

1. बफर तैयारी

नोट: प्रोटीन शुद्धिकरण बफर तैयारी किसी भी दिन हो सकती है; यहां, यह प्रयोगों की शुरुआत करने से पहले किया गया था।

  1. 50 एमएम ट्राइस (हाइड्रोक्सीमिथिल) एमिनोमेथेन (ट्राइस), 300 एमएम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल), 5% ग्लाइस्रोल, और 5 एमएम β-मर्केप्टोथेनॉल (बीएमई), पीएच 8 युक्त लाइसिस/इक्विलिब्रेशन बफर तैयार करें। 1.5 एमएल की 1.5 एमएल, 5एम एनएसीएल की 1.8 एमएल, ग्लाइसरोल की 1.5 एमएल, 25.2 एमएल डिओनाइज्ड वॉटर (डीएच2ओ) को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें और उपयोग से ठीक पहले 14.2 M BME का 10.5 μL जोड़ें।
    नोट: ट्रिस तीव्र विषाक्तता का कारण बन सकता है; इसलिए, इसकी धूल को सांस लेने से बचें, और त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। बीएमई विषाक्त है और केवल एक धूम हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। बीएमई को रीसस्पेन और सेल लाइसिस से ठीक पहले जोड़ना महत्वपूर्ण है। लाइसिस बफर फॉर्मूला के लिए टेबल 1 देखें।
  2. 50 एमएम ट्रिस, 800 एमएमएल एनएसीएल, 5% ग्लाइसरोल, 5 एमएम बीएमई और 20 एमएम इमिडाजोल युक्त वॉश बफर (पीएच 8) तैयार करें। 1 एम ट्रिस का 1.5 एमएल, 5 एम एनएसीएल का 4.8 एमएल, ग्लिसरोल का 1.5 एमएल और डीडीएच 2 ओ का22.2एमएल 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें। उपयोग से ठीक पहले, उपरोक्त समाधान के 20 एमएल में 14.2 एम बीएमई के 7 माइक्रोन और 200 माइक्रोन 2 एम इमिडाजोल जोड़ें।
    नोट: इमिडाजोल के कारण तीव्र विषाक्तता को रोकने के लिए, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। कॉलम से बाहर प्रोटीन धोने से ठीक पहले, बीएमई और इमिडाजोल को जोड़ना महत्वपूर्ण है। वॉश बफर फॉर्मूला के लिए टेबल 2 देखें।
  3. 50 एमएम ट्रिस, 800 एमएमएल एनएसीएल, 5% ग्लाइसरोल, 5 एमएम बीएमई और 200 एमएम इमिडाजोल युक्त एल्यूशन बफर (पीएच8) तैयार करें। 1 एम ट्रिस का 0.5 एमएल, 5 एम एनएसीएल का 1.6 एमएल, ग्लिसरोल का 0.5 एमएल और डीडीएच2ओ का 6.4 एमएल 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें। उपयोग से ठीक पहले, उपरोक्त समाधान के 14.2 एम बीएमई के 3.5 माइक्रोन और 2 एम इमिडाजोल के 1 एमएल को 10 एमएल जोड़ें।
    नोट: कॉलम से बाहर प्रोटीन को eluting करने से ठीक पहले, बीएमई और इमिडाजोल को जोड़ना महत्वपूर्ण है। एल्यूशन बफर फॉर्मूला के लिए टेबल 3 देखें।
  4. 2x स्टोरेज बफर तैयार करें (ग्लाइसेरोल के साथ मिश्रित होने के लिए) जिसमें 100 एमएम ट्रिज़, 200 mM NaCl, 40 m MM बीएमई, और 2 एमएम एथिलीनडाइमाइन्टेस्ट्रेएक्स्ट एसिड (EDTA), एक गैर-आईनिटेंट सामने आने का 0.2% (सामग्री की तालिकादेखें)। 1 एम ट्रिस के 5 एमएल, 5 एम एनएसीएल के 2 एमसीएल,डीडीएच2 ओ के 42.56 एमएल, 05 एम ईडीटीए के 200 माइक्रोन, नॉन-आई सर्फेक्टेंट के 100 माइक्रोन को 50 मीटर सेंटीफ्यूज ट्यूब में जोड़कर स्टोरेज बफर की 50 μL तैयार करें। जब तक समाधान सजातीय न हो जाए तब तक मिक्स करें, 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से स्टोरेज बफर को फ़िल्टर करें, और उपयोग करने से पहले उपरोक्त समाधान में बीएमई का 140.8 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: EDTA के कारण तीव्र विषाक्तता से बचने के लिए, इसकी धूल को सांस लेने से बचें, और त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। बीएमई को अंतिम रूप से जोड़ना महत्वपूर्ण है और शुद्ध प्रोटीन को संग्रहीत करने से ठीक पहले ग्लिसरोल के साथ पूरे स्टोरेज बफर 1:1 को मिलाएं। स्टोरेज बफर फॉर्मूला के लिए टेबल 4 देखें।

2. रातोंरात संस्कृति विकास: दिन 1

  1. डीडीएच2ओ के 10 एमएल में 500 मिलीग्राम कानमाइसिन को घोलकर 1,000x कानामाइसिन स्टॉक तैयार करें।
    नोट: कानमाइसिन के कारण तीव्र विषाक्तता को रोकने के लिए व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें।
  2. 1,000x kanamycin स्टॉक के 20 माइक्रोन को 20 मिलील ऑफ lysogeny शोरबा में जोड़ें। एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करना, एक बदल BL21 ई. कोलाई ग्लिसरोल स्टॉक प्रहार और फिर विकास मीडिया शोरबा में टिप शुरू करके संस्कृति टीका ।

Figure 4
चित्रा 4:स्नैप T7 आरएनएपी के लिए प्लाज्मिड नक्शा। प्लाज्मिड एक T7 आरएनएपी को एन-टर्मिनल हिस्टिडीन टैग (6x हिस्टिडीन टैग) और स्नैप-टैग डोमेन (स्नैप T7 आरएनएपी) को एक पीक्यूई-80एल बैकबोन पर एक लाख दमनकारी (lacI) के तहत एन-टर्मिनल हिस्टिडीन टैग (स्नैप-टैग) के तहत एन-एन कोड करता है। अन्य विशेषताओं में कानमाइसिन प्रतिरोध (कानआर) और क्लोरम्फेनिकोल प्रतिरोध (सीएमआर) जीन शामिल हैं। संक्षिप्त नाम: आरएनएपी = आरएनए पॉलीमरेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: प्लाज्मिड एक T7 आरएनएपी को एन-टर्मिनल हिस्टिडीन टैग और स्नैप-टैग डोमेन (स्नैप-टैग एनएएनपी) के साथ-साथ एक pQE-80L रीढ़(चित्रा 4)25)के तहत एक kanamycin प्रतिरोध जीन युक्त एनकोड करता है ।

  1. फिर, 1,000x कानामाइसिन स्टॉक के 20 माइक्रोन को एक अलग संस्कृति फ्लास्क में जोड़ें जिसमें 20 मिलियन फ्लास्क होता है, जिसमें 20 मिलियन लंग्सोजी शोरबा होता है, और इसे नियंत्रण के रूप में इनक्यूबेट करते हैं।
  2. दो नमूनों (चरण 2.2 और 2.3 से) रात भर 12-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, जबकि 10 × जीपर घूर्णन।

3. सेल विकास और प्रेरण: दूसरा दिन

  1. स्टेप 2.4 से रातोंरात विकास संस्कृति के 4 मिलील के साथ 400 माइक्रोन स्टॉक वाले lysogeny शोरबा के 400 मिलियन μl टीका। संस्कृति फ्लैक्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जबकि 10 × जी पर घूर्णन करें।
  2. एक बार संस्कृति ~ 0.5 के 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) तक पहुंच गई है, तो नियंत्रण के रूप में विकास फ्लास्क से 1 एमएल का नमूना लें। कंट्रोल सैंपल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 0.4 m IPTG की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए संस्कृति के 100 मिलीएल प्रति 1M आईपीटीजी के 40 माइक्रोन जोड़कर आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगलाटॉपाइरानोसाइड (आईपीटीजी) के साथ कोशिकाओं को प्रेरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए नमूना इनक्यूबेट, 10 × जीपर घूर्णन, और फिर कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 10 मिनट के लिए 8,000 × जी पर प्रेरित संस्कृति स्पिन। सुपरनैंट निकालें, और आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली स्टोर करें।
    नोट: आईपीटीजी के कारण तीव्र विषाक्तता से बचने के लिए, इसकी धूल को सांस लेने से बचें, और त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। यदि आवश्यक हो, तो आप यहां प्रयोग को रोक सकते हैं और अगले दिन जारी रख सकते हैं।

4. सेल लाइसिस, प्रोटीन शुद्धिकरण: 3 दिन

  1. बर्फ पर लाइसिस बफर के 10 एमएल के साथ संग्रहीत सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ट करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे घूमता है कि पूरे गोली को फिर से निलंबित कर दिया गया है। फिर, पिपेट 1 एमएल सैंपल में दस 1.5 एमएल ट्यूब में रखा जाता है जो बर्फ पर रखा जाता है।
  2. "1" की एक आयाम सेटिंग में प्रत्येक नमूने को सोनिकेट करें, 30 एस की अवधि में 50% शुल्क चक्र के साथ 2 एस के लिए स्पंदित। प्रत्येक नमूने से पहले और बाद में, 70% इथेनॉल और डीडीएच 2 ओ के साथ सोनीशन टिप को साफ करें। sonication केदौरानऔर बाद में सभी नमूनों को बर्फ पर रखें।
    नोट: गर्मी और खुली लौ से 70% इथेनॉल दूर रखें।
  3. एक निकल-चार्ज नाइट्रालोलीटर एसिड (नी-एनटीए) शुद्धिकरण स्पिन कॉलम को 4 डिग्री सेल्सियस के कामकाजी तापमान पर बराबर करें। कॉलम को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें/स्टोर करें, और उपयोग के दौरान बर्फ पर रखें।
  4. सेंट्रलाइज 15 हजार × जी पर दस 1 एमएल के नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए। ध्यान से गोली को परेशान किए बिना पुनर्संयुक्त आरएनएपी युक्त सुपरनेट बाहर निकालें। यदि आवश्यक हो, तो कुल वॉल्यूम को 6 एमएल में समायोजित करने के लिए अतिरिक्त संतुलन बफर ≥ का उपयोग करें।
  5. कॉलम के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए नी-एनटीए स्पिन कॉलम से नीचे टैब को धीरे से हटा दें। कॉलम को सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें, और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: 3 एमएल नी-एनटीए स्पिन कॉलम के साथ 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब का उपयोग करें।
  6. स्टोरेज बफर को हटाने के लिए 700 × जी और 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कॉलम को सेंट्रलाइज करें। कॉलम में 6 एमएल समतुल्य बफर जोड़कर कॉलम को समतुल्य करें। बफर को पूरी तरह से राल बिस्तर में प्रवेश करने दें।
  7. 700 × जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा कॉलम से संतुलन बफर और 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस निकालें। कॉलम में तैयार सेल एक्सट्रैक्ट को जोड़ने से पहले, किसी भी उत्पाद को खोने से बचने के लिए कॉलम पर एक बॉटम प्लग रखें। फिर, कॉलम में सेल निकालने जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर मिक्सर पर मिलाएं।
  8. कॉलम से नीचे प्लग निकालें और कॉलम को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब लेबल वाले प्रवाहमें रखें। 700 × जी पर कॉलम को 2 मिनट के माध्यम से प्रवाह एकत्र करने के लिए अपकेंद्रित्र करें।
  9. राल धोने के लिए कॉलम में वॉश बफर के 6 एमएल जोड़ें। 2 मिनट के लिए 700 × जी पर कॉलम को एक नए सेंट्रलीफ्यूज ट्यूब लेबल वॉश 1में अंश एकत्र करने के लिए। कुल 3 अलग-अलग अंशों के लिए इस चरण को दो बार दोहराएं, और अलग-अलग अपकेंद्रित्र ट्यूबों(वॉश 2 और वॉश 3)में अंशों को इकट्ठा करें।
  10. राल से अपने टैग किए गए प्रोटीन को स्पष्ट करने के लिए 3 एमएल एल्यूशन बफर जोड़ें। एलुएट 1लेबल वाले नए सेंट्रलाइज ट्यूब में अंश एकत्र करने के लिए 2 मिनट के लिए 700 × ग्राम पर कॉलम को अपकेंद्रित्र करें। कुल 3 अलग-अलग अंशों के लिए इस चरण को दो बार दोहराएं, और अंशों को अलग-अलग अपकेंद्रित्र ट्यूबों(एलुएट 2 और एलुएट 3)में एकत्र करें।
  11. एलुट्स को मिलाएं और प्रोटीन समाधान से लवण को हटाने के लिए डिसल्टिंग करें।
    1. 100 केडीए सेंट्रलाइज्ड फिल्टर यूनिट पर 0.05% डब्ल्यू/वी पॉलीसोर्बेट 20 के पिपेट 15 एमएल। 40 मिनट के लिए 4,000 × जी पर सेंट्रलाइज करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    2. एलुएट फ़िल्टर का उपयोग 1, 2, और 3 (कुल प्रोटीन एल्यूएट + 6 एमएल स्टोरेज बफर के लिए 9 एमएल) को ध्यान केंद्रित करने के लिए ~ 1,500 माइक्रोएल करें। 20 मिनट के लिए 3,220 × ग्राम पर फ़िल्टर को अपकेंद्रित्र करें, और धीरे-धीरे पिपेट-वर्षा को रोकने के लिए झिल्ली को धोएं।
    3. भंडारण बफर के साथ 15 एमएल के लिए नमूना पतला। दो बार चरण 4.11.2 दोहराकर भंडारण बफर 1:1,000 का उपयोग करके एक बफर एक्सचेंज करें।
  12. 280 एनएम पर अंश के अवशोषण को मापकर शुद्ध प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें। स्टोरेज बफर (4 डिग्री सेल्सियस पर 2x स्टोरेज बफर) के साथ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को ब्लैंक करें। धीरे-धीरे संयुक्त एलुइट्स के नमूने को मिलाएं और इसके अवशोषण को मापें।
    नोट: प्रोटीन के नमूने के 1x, 10x और 50x कमजोर पड़ने पर तीन अलग-अलग रीडिंग को औसत और प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें। भंडारण बफर में नमूनों को पतला करें।
  13. प्रोटीन के नमूनों को 2x स्टोरेज बफर का उपयोग करके 100 माइक्रोनएम में समायोजित करें। समायोजित नमूना 1:1 100% ग्लाइस्रोल के साथ मात्रा से पतला करें। परिणामी प्रोटीन समाधान को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) प्रोटीन उत्पाद का विश्लेषण: दिन 3

  1. प्रोटीन विश्लेषण के लिए एक एसडीएस-पेज जेल चलाएं। 4x लिथियम डॉडेक्सिल सल्फेट (एलडीएस) प्रोटीन लोडिंग डाई के 3 माइक्रोन के साथ नमूने के 9 माइक्रोन मिलाएं। नमूनों को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  2. नमूनों को 4-12% बीआईएस-ट्रिस एसडीएस-पेज जेल सेटअप पर लोड करें। प्रोटीन सीढ़ी को अच्छी तरह से 1 में लोड करें, फिर नमूनों के साथ (बाएं से दाएं): प्रवाह के माध्यम से, 1 धोना, 2 धोना, 3 धोना, एल्यूशन 1, एल्यूशन 2, एल्यूशन 3, और कुल विलसल्टेड एल्यूशन।
    नोट: तालिका 5 में एसडीएस-पेज जेल के लिए एक नमूना लोडिंग टेबल शामिल है।
  3. 2 में लोडेड जेल नमूनों को चलाएं-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेलिफोनिक एसिड (एमईएस) बफर २०० वी पर ३५ मिनट के लिए । एक साफ ट्रे में जेल कुल्ला तीन मिनट के लिए 10 मिनट के लिए प्रत्येक ddH2O के २०० एमएल का उपयोग कर, कोमल आंदोलन के साथ जेल मैट्रिक्स से किसी भी एसडीएस को हटाने के लिए ।
    नोट: एमईएस के कारण तीव्र विषाक्तता से बचने के लिए व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  4. कूमासी ब्लू के 20 एमएल के साथ जेल को दाग दें, और कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर रात भर जेल को इनक्यूबेट करें। एक कक्षीय शेखर पर कोमल आंदोलन के साथ डीडीएच 2 ओ के 200 एमएल के साथ1घंटे प्रत्येक के लिए दो बार जेल दाग।
    नोट: लंबी अवधि के लिए जेल धोना या अक्सर पानी की जगह संवेदनशीलता में वृद्धि करेगा। इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त डाई को अवशोषित करने के लिए कंटेनर में एक तह नाजुक-कार्य पोंछ ऊतक रखने से डी-धुंधला प्रक्रिया में तेजी आएगी।

6. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से स्नैप T7 आरएनएपी का कार्यात्मक सत्यापन

नोट: यह प्रोटोकॉल डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करता है, जो फ्लोरोसेंट ब्रोकोली आरएनए इप्टमर के लिए एन्कोड करता है और फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर पर प्रतिलेखन के गतिज की निगरानी करने के लिए फ्लोरेसेंस के उपयोग की अनुमति देता है।

  1. एक वाणिज्यिक स्रोत और एक बफर-केवल नियंत्रण से जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) T7 आरएनएपी के साथ स्नैप T7 आरएनएपी की गतिविधि की तुलना करने के लिए तीन इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) प्रतिक्रियाओं की स्थापना करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया की मात्रा को 20 माइक्रोन में समायोजित करें।
    1. 10x ट्रांसक्रिप्शन बफर के 2 माइक्रोन मिश्रण से स्नैप T7 आरएनएपी आईवीटी प्रतिक्रिया तैयार करें, 25 एमएम राइबोन्यूकोसाइड ट्राइफॉस्फेट (आरएनटीपी) मिक्स का 0.4 माइक्रोन, 500 एनएम डीएनए टेम्पलेट का 5 माइक्रोन, 500 एनएम स्नैप टी 7 आरएनएपी का 2 माइक्रोल और डीडीएच 2 ओ का10.6माइक्रोन।
    2. 10x ट्रांसक्रिप्शन बफर के 2 माइक्रोन, 25 एमएम आरएनटीपी मिक्स के 0.4 माइक्रोन, 5 μL के 5 एनएम डीएनए टेम्पलेट, डब्ल्यूटी टी 7 आरएनएपी के 2 माइक्रोन और डीडीएच2ओ के 10.6 माइक्रोन को मिलाकर डब्ल्यूटी आरएनएपी आईवीटी रिएक्शन तैयार करें।
    3. 10x ट्रांसक्रिप्शन बफर के 2 माइक्रोन, 25 एमएम आरएनटीपी मिक्स के 0.4 माइक्रोन, 5 μL के 5 एनएम डीएनए टेम्पलेट और डीडीएच2ओ के 12.6 माइक्रोन मिलाकर बफर-केवल आईवीटी रिएक्शन तैयार करें।
      नोट: आरएनएपी पिछले जोड़ें, इसके परिचय तक बर्फ पर नमूने रखते हुए । तालिका 6, तालिका 7,और तालिका 8 में आईवीटी प्रतिक्रिया सूत्र होते हैं।
  2. 470 एनएम की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 512 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के अंतराल पर 2 घंटे के लिए फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर पर ट्रांसक्रिप्शन काइनेटिक्स की निगरानी करें।

7. बीजी-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की तैयारी: दिन 1

  1. 1 mm की अंतिम एकाग्रता के लिए डीडीएच2ओ में 3'-अमीन संशोधन के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को भंग करें। इस S1लेबल ।
    1. 1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3),100% डिमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 25 माइक्रोल मिलाएं, S1 (ओलिगोन्यूक्लियट) का 125 माइक्रोन आईडी स्टॉक), और बीजी-एन-हाइड्रोक्सीस्यूसिनिमाइड (एनएचएस) एस्टर (बीजी-जीएलए-एनएचएस) के 50 mm के 66 माइक्रोन, डीएमएसओ के साथ पतला, मात्रा को 500 माइक्रोल में समायोजित करें, और 100 × जीपर कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट .
      नोट: DMSO गर्मी और लौ से दूर रखें क्योंकि यह एक दहनशील तरल है । तालिका 9 में अल्पाधिकार के लिए बीजी संवत् के लिए प्रतिक्रिया सूत्र शामिल है।

8. बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड कंजूगेट की इथेनॉल/एसीटोन वर्षा: 2 दिन

  1. स्टेप 7.1.1 के उत्पाद को सेंट्रलाइज करें। 5 मिनट के लिए 13,000 × जी पर। एक ताजा ट्यूब में सुपरनेट को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और किसी भी उपजी बीजी को त्याग दें। ओवरफ्लो को रोकने के लिए प्रतिक्रिया को दो बराबर 250 माइक्रोन एलिकोट में विभाजित करें, और दोनों अलीकोट पर निम्नलिखित चरणों को करें।
  2. 3 एम सोडियम एसीटेट(25 माइक्रोल) की मात्रा का 1/10 जोड़ें, इसके बाद 100% इथेनॉल (625 माइक्रोन) में 2.5x वॉल्यूम करें। 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: सोडियम एसीटेट (आंखों, त्वचा, पाचन और श्वसन तंत्र में जलन हो सकती है) और इथेनॉल (बेहद ज्वलनशील, संपर्क पर जलन का कारण बनता है) दोनों को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो यहां प्रयोग को विराम दें और अगले दिन जारी रखें।
  3. ट्यूबों को अपकेंद्रित्र में रखें, और बाहरी किनारे को चिह्नित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 17,000 × जी पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
    नोट: ओलिगोन्यूक्लियोटाइड गोली ट्यूब के चिह्नित किनारे पर दिखाई देगी।
  4. पैलेट को परेशान किए बिना, सुपरनिटेंट को त्याग दें। ठंडा 70% इथेनॉल के 750 माइक्रोन के साथ टॉप अप, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 × जी पर स्पिन।
  5. पैलेट को परेशान किए बिना, सुपरनिटेंट को त्याग दें। 100% एसीटोन के 750 माइक्रोन के साथ टॉप अप करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 × जी पर स्पिन करें।
    नोट: एसीटोन को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें क्योंकि यह बेहद ज्वलनशील है और संपर्क पर जलन का कारण बनता है।
  6. ट्यूब ढक्कन खुला होने के साथ, वाष्पीकरण के माध्यम से किसी भी अतिरिक्त एसीटोन को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए हवा सूखी। ~850 माइक्रोन बीजी-ओलिगोन्यूक्लियटाइड समाधान का उत्पादन करने के लिए 1x ट्रिस-ईडीटीए (टीई) बफर के 250 माइक्रोन में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को फिर से भंग करें।
  7. चरण 8.2 से 8.6 तक दोहराएं, और 1x TE बफर के 70 माइक्रोन में फिर से भंग करें। इस S2लेबल ।

9. जेल फिल्ट्रेशन क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सफाई

  1. कई बार कॉलम को सख्ती से उलटा करके मैट्रिक्स को निलंबित करें; शीर्ष टोपी निकालें और कॉलम के नीचे टिप से स्नैप करें। कॉलम को 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें, और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें। eluted बफर और संग्रह ट्यूब त्यागें।
    नोट: वैक्यूम गठन को रोकना महत्वपूर्ण है। तैयार कॉलम का तुरंत उपयोग करें।
  2. पैक किए गए कॉलम को साफ 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें। कॉलम बिस्तर के केंद्र में 1x TE बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें, और बफर समाधान का आदान-प्रदान करने के लिए 2 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। एक बार फिर, eluted बफर और संग्रह ट्यूब त्यागें।
  3. बफर-एक्सचेंज किए गए कॉलम को साफ 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें। बिस्तर के केंद्र में नमूने के 75 माइक्रोन तक लागू करें। 4 मिनट के लिए 1,000 × जी पर स्पिन करें।
    नोट: बिस्तर को परेशान न करें या कॉलम के किनारों को न छुएं; जेल मीडिया का उच्चतम बिंदु बाहर रोटर की ओर इशारा करना चाहिए।
  4. संग्रह ट्यूब से एल्यूएट ले लीजिए, क्योंकि इसमें शुद्ध न्यूक्लिक एसिड होता है। नमूने की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 260 एनएम पर इसके अवशोषण को मापें; इस S3 लेबल।
    नोट: माप में उपयोग की जाने वाली पथ लंबाई पर ध्यान दें, और बीयर-लैम्बर्ट कानून का उपयोग करके एकाग्रता की गणना करें।

10. बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड कंजूगेट के पृष्ठ विश्लेषण को विकृत करना

  1. 18% ट्रिस-बोरेट-एडटा (BE) -यूरिया पेज जेल कास्ट करें। 4.8 ग्राम यूरिया, 40% एक्रिलामाइड (19:1) के 4.5 एमएल और डीडीएच 2 ओ के 2.8 एमएल में 10x एचबीई का1एमएल घोलें; 5 माइक्रोन टेट्रामेथाइलेथिलेलेंडिमाइन (TEMED) जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। 10% अमोनियम persulfate (एपीएस) के 100 माइक्रोन के साथ दोहराएं। समाधान को एक खाली जेल कैसेट में डालें और 40 मिनट के लिए बहुलीकरण की अनुमति दें।
    नोट: यूरिया से निपटने के दौरान उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें (आंखों और त्वचा में जलन का कारण बनता है), एक्रिलामाइड (विषाक्त और कैंसरजनक), और TEMED (विषाक्त, ज्वलनशील, संक्षारक)। तालिका 10 में 18% TBE-यूरिया पॉलीएक्रीलामाइड जेल के लिए प्रतिक्रिया फार्मूला शामिल है।
  2. माइक्रोवेव 500 एमएल का एफबीई बफर (0.5x) 2 मिनट और 30 एस के लिए या ~ 70 डिग्री सेल्सियस तक और एक जेल उपकरण में डालना। 95% फॉर्ममाइड + 1 एमएम ईडीटीए और ब्रोमोफेनॉल ब्लू युक्त फॉर्ममाइड (डेन्चरिंग) लोडिंग डाई तैयार करें। लोडिंग डाई को प्रत्येक नमूने के साथ मिलाएं, और मिश्रण को पॉलीएक्रेलैमाइड जेल पर लोड करें।
    नोट: फॉर्मामाइड को संभालते समय उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें क्योंकि यह कैंसरजनक है। तालिका 11 में एक नमूना जेल लोडिंग टेबल शामिल है।
  3. 35 मिनट के लिए 270 वी पर जेल चलाएं, या जब तक डाई सामने अंत तक माइग्रेट न हो जाए। एक जेल बॉक्स में जेल रखें और इमेजिंग से पहले कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए न्यूक्लिक एसिड के लिए साइनिन डाई के साथ दाग।
    नोट: साइनिन डाई को संभालते समय उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें क्योंकि यह दहनशील है।

11. स्नैप T7 आरएनएपी और पेज विश्लेषण के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड का संजीत्र

  1. स्नैप T7 RNAP को बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के विश्लेषणात्मक पैमाने पर युग्मन के लिए रिएजेंट्स तैयार करें: ओलिगो बनाने के लिए डीडीएच2ओ के साथ एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) ओलिगो के 9 कमजोर पड़ने बनाएं: आरएनएपी अनुपात 5:1 से 1:5 तक। प्रोटीन स्टॉक को 50 माइक्रोन तक पतला करें।
    नोट: उदाहरण अनुपात तालिका 12में पाया जा सकता है; इन अनुपातों की गणना 50 माइक्रोन की आरएनएपी एकाग्रता का उपयोग करके की जाती है।
  2. एसएसडीएनए ओलिगो के प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए, स्नैप बफर के 2 माइक्रोन, बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के 4 माइक्रोन और स्नैप T7 आरएनएपी के 4 माइक्रोन युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 माइक्रोन बनाएं।
    नोट: तालिका 13 में स्नैप-टैग लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए प्रतिक्रिया सूत्र शामिल हैं।
    1. दो और नियंत्रण नमूने तैयार करें: 1) बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को डीएच2ओ के साथ बदलकर आरएनएपी नियंत्रण; 2) डीएच2ओ के साथ स्नैप टी 7 आरएनएपी की जगह एक डीएनए नियंत्रण (स्नैप T7 आरएनएपी की सबसे कम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड एकाग्रता के लिए)। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सभी नमूनों को इनक्यूबेट करें, और जरूरत होने तक बर्फ पर रखें।
  3. स्नैप बफर के 4 माइक्रोन और प्रोटीन लोडिंग डाई के 2 माइक्रोन में प्रत्येक नमूने के 2 माइक्रोन जोड़कर ग्यारह 10 माइक्रोल प्रतिक्रियाओं को सेट करें, और 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी करें। 4-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जेल पर प्रत्येक नमूने का 2 माइक्रोन लोड करें, और 35 मिनट के लिए 200 वी पर बर्फ पर जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस करें।
    नोट: तालिका 14 में जेल लोडिंग नमूनों के लिए प्रतिक्रिया सूत्र शामिल हैं।
    1. एक शेखर पर 3x पानी-विनिमय के माध्यम से SDS धोएं, प्रत्येक 10 मिनट तक चलने वाले प्रत्येक को धोएं। इमेजिंग से पहले 15 मिनट के लिए न्यूक्लिक एसिड के लिए साइनिन डाई के साथ दाग। 1 घंटे के लिए कूमासी नीले दाग के 20 एमएल का उपयोग करके जेल को फिर से दाग दें। इमेजिंग से पहले 1 घंटे (या रात भर) के लिए डीडीएच2ओ के साथ डी-दाग।
      नोट: जेल में, प्रतिक्रियाओं में से एक अतिरिक्त मुक्त बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड की कम से कम मात्रा के साथ सबसे सीमित बहुलक का उत्पादन करेगा; यह इष्टतम अनुपात है।
  4. स्नैप T7 आरएनएपी के लिए तैयारी पैमाने पर युग्मन बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के लिए अभिकर्मक तैयार करें। विश्लेषणात्मक पैमाने में पाए जाने वाले इष्टतम अनुपात के साथ युग्मन प्रतिक्रिया करें।
    नोट: उपयोग में नहीं होने पर बर्फ पर प्रोटीन रखकर कमरे के तापमान के लिए प्रोटीन जोखिम को कम करें।

12. आयन एक्सचेंज कॉलम का उपयोग करके ओलिगोन्यूक्लियोटाइड-सीमित स्नैप-टी 7 का शुद्धिकरण

  1. ट्यूब सेटअप के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें यदि यह यहां सूचीबद्ध निर्देशों से भटक जाता है। प्रोटीन के आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट से ज्यादा पीएच के साथ शुद्धि बफर तैयार करें।
    नोट: उदाहरण के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रोटीन, 10 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7) का शुद्धिकरण बफर का उपयोग किया गया था।
    1. 50 एमएम ट्रिस और 0.5 एम एनएसीएल की अंतिम सांद्रता वाले 1,000 μL एल्यूशन बफर तैयार करें। 1 एम ट्रिस के 50 माइक्रोन, 5 एम एनएसीएल के 100 माइक्रोन, और डीडीएच2ओ के 850 माइक्रोल मिलाएं।
      नोट: तालिका 15 में एल्यूशन बफर के लिए प्रतिक्रिया सूत्र शामिल है।
  2. एक कॉलम को 2 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें, और 15 मिनट के लिए 2,000 × जी पर शुद्धि बफर के साथ धोएं, या जब तक कि सभी बफर को eluted नहीं किया गया हो। एलुट बफर को छोड़ दें।
  3. एक 3:1 शुद्धिकरण बफर पर शुद्धिकरण बफर के साथ प्रत्येक नमूना पतला: नमूना अनुपात, और एक समय में कॉलम 400 μL में नमूना लोड। 10 मिनट के लिए 2,000 × जी पर स्पिन करें, या जब तक कि सभी बफर को नहीं किया गया हो। प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और यह प्रवाह के माध्यम सेके रूप में लेबल ।
  4. कॉलम के केंद्र में शुद्धि बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें। 15 मिनट के लिए 2,000 × जी पर स्पिन करें, या जब तक कि सभी बफर को eluted नहीं किया गया है। प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और इसे धोने केरूप में लेबल 1 । धोने के लिए दो बार और दोहराएं 2 और धोने के लिए 3।
  5. कॉलम के केंद्र में 50 μl एल्यूशन बफर जोड़ें। 5 मिनट के लिए 2,000 × जी पर स्पिन करें, या जब तक कि सभी बफर को नहीं किया गया हो। प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और यह eluate 1के रूप में लेबल । एलुएट 2 और एलुएट 3के लिए दो बार और दोहराएं ।
  6. पूल 1, 2, और 3 (इस कुल एल्यूएटलेबल) को समाप्त करता है, जिससे जेल के लिए प्रत्येक एल्यूएट का एक छोटा सा अंश छोड़ दिया जाता है, और 260 एनएम (A260) और 280 एनएम (A280) पर अवशोषण को मापता है। माप के बाद, 1:1 अनुपात में ग्लाइस्रोल जोड़ें और आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. 2x स्टोरेज बफर (~ 1:100) (इस उत्पादको लेबल) के साथ बफर-एक्सचेंज टोटल एल्यूएट करने के लिए सेंट्रलाइज्ड फिल्टर यूनिट (0.5 एमएल; 30 केडीए) का उपयोग करें। उपाय A260/280 फिर से । 1:1 अनुपात में ग्लाइसरोल जोड़ें और आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. प्रत्येक एलुएट लोड करें: प्रवाह के माध्यम से, 1-3 धोने, कुल एल्युएट, और उत्पाद 4-12% बीआईएस-ट्रिस एसडीएस-पेज जेल में, प्रोटीन सीढ़ी के साथ। 35 मिनट के लिए 200 वी पर चलाएं, या जब तक डाई सामने अंत तक माइग्रेट नहीं होता है।

13. सीमित आरएनए बहुलक गतिविधि के ऑन-डिमांड नियंत्रण का प्रदर्शन

  1. 25 एमएम ट्रिस, 5 एमएम ईडीटीए और 25 एमएम मैग्नीशियम क्लोराइड (एमजीसीएल2)वाले 5x एनीलिंग बफर तैयार करें। प्रत्येक टेम्पलेट (1 माइक्रोन) के 2.4 माइक्रोन को एनीमलिंग बफर के 5 माइक्रोन के साथ और डीडीएच2ओ के 14.2 माइक्रोन के साथ 1 माइक्रोन डी 2 मिलियन के पिंजरे के 25 माइक्रोन के रूप में मिलाएं। 2 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान को इनक्यूबेट करें। इसी तरह, प्रमोटर और मैलाकाइट ग्रीन इप्टामर डीएनए टेम्पलेट की भावना और एंटीसेंस किस्में एनील करें। मैलाकाइट ग्रीन ऑक्सलेट का 1mM घोल तैयार करें।
    नोट: तालिका 16 में 5x एनीलिंग बफर के लिए प्रतिक्रिया सूत्र शामिल है, तालिका 17 में दो एसडीएनए टेम्पलेट्स को एनीलिंग करने के लिए प्रतिक्रिया सूत्र शामिल है।
  2. 500 एनएम आरएनएपी की अंतिम एकाग्रता के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1:5 मोलर अनुपात में डीएसडीएनए पिंजरे के साथ सीमित स्नैप T7 आरएनएपी को इनक्यूबेट करें। जरूरत होने तक बर्फ पर रखें।
  3. प्लेट रीडर को 37 डिग्री सेल्सियस से पहले गरम करें। बर्फ पर तीन 25 μL IVT प्रतिक्रियाओं की स्थापना
    1. न्यूक्लिक एसिड ट्रांसक्रिप्शन कारकों के साथ बंदी स्नैप T7RNAP युक्त एक प्रतिक्रिया की स्थापना की। 10x आईवीटी बफर के 2.5 माइक्रोन, 25 एमएमएम आरएनटीपी मिक्स के 1 माइक्रोल, 1 एमएम मैलाकाइट ग्रीन का 1 माइक्रोन, आरएनएपी-केज मिश्रण का 2.5 माइक्रोन, 1 माइक्रोन ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए और बी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड किस्में में से प्रत्येक में2.5माइक्रोन, और डीडीएच 2 ओ के 10 L में 1 एमएम मैलाकिट ग्रीन इप्टामर टेम्पलेट के 3 माइक्रोन।
    2. न्यूक्लिक एसिड ट्रांसक्रिप्शन कारकों के बिना बंदी स्नैप T7RNAP युक्त एक प्रतिक्रिया की स्थापना की। मिक्स 10x IVT बफर के 2.5 माइक्रोन, 25 एमएम आरएनटीपी मिक्स के 1 माइक्रोन, 1 एमएम मैलाकाइट ग्रीन के 1 माइक्रोन, आरएनएपी-केज मिश्रण का 2.5 माइक्रोन, और डीडीएच2ओ के 15 माइक्रोन में 1 एमएम मैलाटाइट ग्रीन एप्टा टेम्पलेट का 3 माइक्रोन मिलाएं।
    3. केवल बफर युक्त प्रतिक्रिया सेट करें। 10x IVT बफर के 2.5 माइक्रोन, 25 एमएम आरएनटीपी मिक्स के 1 माइक्रोन, 1 एमएम मैलाकाइट ग्रीन के 1 माइक्रोन और डीडीएच2ओ के 17.5 माइक्रोन में 1 एमएम मैलाकिट ग्रीन इप्टमर टेम्पलेट के 3 माइक्रोन मिक्स करें।
      नोट: तालिका 18 में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं के लिए एक सामान्य संदर्भ शामिल है।
  4. प्रत्येक प्रतिक्रिया को 384-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर पर मैलाकाइट ग्रीन इप्टमर के प्रतिलेखन की निगरानी करें और 610 एनएम उत्तेजना और 655 एनएम उत्सर्जन के साथ। एक बार समाप्त हो जाने के बाद, जरूरत होने तक प्लेट को बर्फ पर रखें।
  5. माइक्रोवेव 0.5x TBE बफर 2 मिनट 30 एस के लिए या ~70 डिग्री सेल्सियस तक। 20 मिनट के लिए 280 वी पर गर्म 0.5x TBE बफर में गर्म 0.5x TBE बफर में एक denaturing 12% TBE-यूरिया पॉलीएक्रिअलमाइड जेल में प्रत्येक अच्छी तरह से आरएनए उत्पादों को चलाएं, या जब तक डाई सामने अंत तक पहुंचता है। इमेजिंग से पहले एक कक्षीय शेखर पर 10 मिनट के लिए साइनिन डाई न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ जेल दाग।
    नोट: तालिका 19 में 12% TBE-यूरिया पेज जेल के लिए प्रतिक्रिया फार्मूला शामिल है।

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Representative Results

Figure 5
चित्रा 5:SDS-स्नैप T7 RNAP अभिव्यक्ति और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख के पृष्ठ विश्लेषण । (A)SNAP T7 RNAP प्रोटीन शुद्धिकरण विश्लेषण, स्नैप T7 RNAP आणविक वजन: 119.4kDa । कॉलम से एफटी = प्रवाह-माध्यम से, W1 = अशुद्धियों वाले वॉश बफर के अंश, ई 1-3 = शुद्ध उत्पाद वाले एल्यूशन अंश, और डीई = 10x पतला कुल विल्रेटेड एल्यूशन। 4-12% प्रीकास्ट बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जेल, दाग: कूमासी ब्लू, रनिंग बफर: एमईएस बफर, स्थितियां: 35 मिनट के लिए 200 वी।(बी)समय के साथ फ्लोरोसेंट इप्टमर के उत्पादन को मापकर स्नैप टी 7 आरएनएपी प्रोटीन पर एक इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख का प्रदर्शन किया गया। ट्रांसक्रिप्शन काइनेटिक्स पर 470 एनएम पर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 512 एनएम पर उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के अंतराल पर 2 घंटे के लिए फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर पर नजर रखी गई। संक्षिप्त रूप: आरएनएपी = आरएनए पॉलीमरेज; एमईएस = 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेलसुल्फोनिक एसिड; SDS-PAGE = सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सफल अभिव्यक्ति और recombinant स्नैप T7 RNAP प्रोटीन के शुद्धिकरण SDS-पृष्ठ(चित्रा 5A)का उपयोग कर पुष्टि की थी । स्नैप टी 7 आरएनएपी के लिए बैंड लगभग 119 केडीए पर अपेक्षित है, जो जंगली-प्रकार T7 RNAP के आणविक वजन के अनुरूप है और स्नैप-टैग क्रमशः 99 केडीए और 20 केडीए है। यहां वर्णित उनके टैग शुद्धिकरण प्रक्रिया ने कुल सात अंशों का उत्पादन किया, जिसमें एक प्रवाह-माध्यम अंश (एफटी), तीन धोने के अंश (W1, W2, और W3), और तीन एल्यूशन अंश (E1, E2, और E3) शामिल हैं। इसके अलावा, बफर एक्सचेंज और अप-एकाग्रता (डीई) के बाद प्रोटीन का एक एलिकोट भी आम तौर पर शामिल है। जैसा कि चित्रा 5Aमें देखा गया है, सबसे प्रमुख बैंड सफल प्रोटीन अभिव्यक्ति का सुझाव देते हुए, एल्यूशन अंशों में लगभग 119 केडीए में दिखाई दिया। अधिकांश प्रवाह-थ्र्यल और वॉश अंशों में कच्चे तेल की सेल lysates निहित है। सेल के एक छोटे से हिस्से को एल्यूशन अंशों पर ले जाया जाता है, जिससे यह सुझाव मिलता है कि अधिक कठोर वॉश किए जाने की आवश्यकता होती है, हालांकि इससे प्रोटीन उत्पाद की उपज कम हो सकती है। मुख्य स्नैप T7 RNAP बैंड के अलावा, एक दूसरे, कम प्रमुख बैंड लगभग 20 केडीए, जो छोटा स्नैप टैग प्रोटीन के लिए जिंमेदार ठहराया गया था पर मनाया गया था । बैंड तीव्रता के आधार पर, यह उप-उत्पाद स्नैप T7 आरएनएपी की तुलना में एकाग्रता में काफी कम था। इसे 100 केडीए आणविक वजन कट-ऑफ फिल्टर के साथ आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी या डायफिल्ट्रेशन के अतिरिक्त दौर से हटाया जा सकता है। एसडीएस-पेज के बाद, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन(चित्रा 5B)का उपयोग करके एंजाइमेटिक गतिविधि को मान्य किया गया था। फ्लोरोसेंट आरएनए इप्टामर (जैसे, मैलाकोट ग्रीन26)का उपयोग किया गया था, जो फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर का उपयोग करके आरएनए उत्पादन काइनेटिक्स की निगरानी की अनुमति देता है, साथ ही पॉलीमेरेरेस के विभिन्न बैचों या डिजाइनों के बीच ट्रांसक्रिप्शन काइनेटिक्स की तुलना करता है।

Figure 6
चित्र 6:बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड कंजूगेशन और शुद्धिकरण का पृष्ठ विश्लेषण। बीजी को मानक अमीन रसायन शास्त्र के माध्यम से ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के 3'-अंत पर संयोजित किया गया था। बीजी-कार्यात्मक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संजूगेट्स को आकार के बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी स्पिन कॉलम का उपयोग करके अतिरिक्त उत्पादों से शुद्ध किया गया था और साइनिन डाई न्यूक्लिक एसिड दाग के बाद 18% TBE-यूरिया पेज पर विश्लेषण किया गया था। इस जेल में अल्ट्रा-लो रेंज डीएनए सीढ़ी का इस्तेमाल किया गया था। S1 = ओलिगोन्यूक्लियोटाइड, S2 = पूर्व शुद्धि बीजी-ओलिगो, S3 = पोस्ट-शुद्धि बीजी-ओलिगो। संक्षिप्त रूप: पेज = पॉलीएक्रिलेमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस; बीजी = बेंजीलगुआनिन; TBE = Tris-borate-EDTA; EDTA = एथिलेंडियामाइन टेट्राएसेटिक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बीजी-कार्यात्मक ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स को मानक अमीन-प्रतिक्रियाशील क्रॉसलिंकिंग रसायन विज्ञान (यानी, बीजी-जीएलए-एनएचएस एस्टर को अमीन-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ प्रतिक्रिया देने) का उपयोग करके तैयार किया गया था। सफल युग्मन 18% denaturing TBE-यूरिया पृष्ठ(चित्रा 6) केमाध्यम से सत्यापित किया गया था । असंशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (S1) की तुलना में, ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के लिए बीजी मोदित्य के अलावा इसका आणविक वजन बढ़ जाता है और बीजी-संशोधित ओलिगो (S3) को जेल में धीमी यात्रा करने का कारण बनता है। इस एकल-न्यूक्लियोटाइड अंतर का निरीक्षण करने के लिए उच्च प्रतिशत विकृत जेल का उपयोग आवश्यक है। पेज विश्लेषण को विकृत करना भी जटिल दक्षता में बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता की विशेषता के लिए उपयोगी है, क्योंकि जेल पर अलग-अलग बैंड के रूप में संयुग्मित और अविजित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दोनों को हल किया जा सकता है। यदि उत्पाद में अविजित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड की एक महत्वपूर्ण मात्रा होती है, तो पूरा होने की प्रतिक्रिया को चलाने के लिए रासायनिक युग्मन का दूसरा दौर लागू किया जा सकता है।

Figure 7
चित्रा 7:T7 RNAP-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड कंजूगेशन और शुद्धिकरण का एसडीएस-पेज विश्लेषण। एक बीजी-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को स्नैप-टैग के माध्यम से T7 आरएनएपी के लिए संयुग्मित किया जाता है। संजूगेट्स को मजबूत टैन एक्सचेंज स्पिन कॉलम का उपयोग करके अतिरिक्त ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स से शुद्ध किया गया था, इससे पहले एसडीएस-पेज दोनों(ए)साइनिन डाई न्यूक्लिक एसिड दाग और(बी)कूमासी नीले दाग के साथ दाग दिया जा रहा था। इस जेल में एक प्रोटीन सीढ़ी और 10 बीपी डीएनए सीढ़ी दोनों का इस्तेमाल किया गया था । एफटी = प्रवाह के माध्यम से कॉलम से, W1-W3 = शुद्धता युक्त बफर के एल्यूशन अंश, ई = शुद्ध उत्पाद वाले पूल्ड एल्यूशन अंश, छानने के बाद उत्पाद = शुद्ध उत्पाद और अप-एकाग्रता, सी = स्नैप टी 7 आरएनएपी केवल नियंत्रण के रूप में। इस आंकड़े को चाउ और शिह27से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त रूप: आरएनएपी = आरएनए पॉलीमरेज; SDS-PAGE = सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

स्नैप T7 RNAP और बीजी संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के उत्पादन के बाद, डीएनए-सीमित आरएनएपी का संश्लेषण एक सरल एक बर्तन मिश्रण प्रतिक्रिया थी । जिसके परिणामस्वरूप डीएनए-सीमित T7 आरएनएपी को एक मजबूत टैस एक्सचेंज स्पिन कॉलम का उपयोग करके अतिरिक्त बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड से शुद्ध किया गया था और एसडीएस-पेज(चित्र 7)को विकृत करके विश्लेषण किया गया था। पिछले पैराग्राफ में वर्णित उनके टैग शुद्धिकरण योजना के साथ, प्रारंभिक प्रवाह-थ्री (एफटी), तीन धोने के अंश (W1 से W3), पूल किए गए संयुव अंश (ई), अप-केंद्रित उत्पाद (पी), और अविजित T7 आरएनएपी (सी) युक्त नियंत्रण सहित कुल सात अंशों का विश्लेषण किया गया था। सफल संजीदगी को सत्यापित करने के लिए, जेल को पहले न्यूक्लिक एसिड के लिए सायनिन डाई से सना हुआ था, जिसके बाद प्रोटीन के लिए कूमासी ब्लू था। जैसा कि साइनिन डाई-सना हुआ जेल(चित्रा 7A)में देखा जा सकता है, प्रारंभिक एफटी में ज्यादातर अतिरिक्त बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड, साथ ही डीएनए-टेथर्ड पॉलीमरेज (यानी, आरएनएपी-ओलिगो) का एक छोटा सा हिस्सा शामिल था जो टैशन एक्सचेंज राल से बांध नहीं था।

धोने के अंशों में जेल के तल पर बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (W1-W3) के बेहोश बैंड की एक श्रृंखला शामिल थी। यह अतिरिक्त ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को सफलतापूर्वक हटाने का सुझाव देता है। पूल्ड एल्यूशन अंश (ई) में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड टेथर के लिए साइनिन डाई के बंधन के कारण आरएनएपी-ओलिगो का केवल एकल बैंड था। यदि लेन ई में मुफ्त ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के बैंड होते हैं, तो उन्हें नमूने से हटाने के लिए अधिक धोने के कदम की आवश्यकता हो सकती है। फ़िल्टर और अप केंद्रित उत्पाद (पी) युक्त लेन ई के रूप में एक ही बैंड दिखाया है, लेकिन बहुत गहरा, वाचक है कि ऊपर एकाग्रता प्रक्रिया सफल रहा था । प्रोटीन नियंत्रण स्तंभ में केवल प्रोटीन था, जिसमें साइन डाई के लिए न्यूनतम गैर-विशिष्ट बाध्यकारी का प्रदर्शन किया गया, जिसे बेहोश बैंड के रूप में देखा गया । Coomassie नीले दाग जेल(चित्रा 7B)में एक ही पैटर्न मनाया गया । ओलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित आरएनएपी की तुलना गैर-संयुग्मित आरएनएपी नियंत्रण से करते समय एक छोटा जेल गतिशीलता बदलाव देखा गया।

Figure 8
चित्रा 8:बंदी बहुलक प्रणाली के ओन और ऑफ स्टेट्स के विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख में। (ए)योजनाबद्ध बंदी और अनकैज्ड राज्यों में T7 आरएनएपी का चित्रण । (बी और सी) फ्लोरोसेंट इप्टामर के उत्पादन को मापकर पॉलीमरेज के बंदी और अनकॉग्ड राज्यों पर एक इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख का प्रदर्शन किया गया था। इस आंकड़े में दिखाया गया है पर और बंद राज्यों के बीच प्रतिलेखन दर में 336x वृद्धि हुई है । त्रुटि सलाखों मानक विचलन (n= 3) का संकेत मिलता है। इस आंकड़े को चाउ और शिह27से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त रूप: आरएनएपी = आरएनए पॉलीमरेज; TF = प्रतिलेखन कारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सीमित आरएनए पॉलीमरेज प्रणाली में ट्रांसक्रिप्शनल क्षमता के ऑन-डिमांड स्विचिंग के लिए एक विधि प्रदर्शित करने के लिए, एक डीएनए टेम्पलेट डिजाइन जिसने न्यूक्लिक-एसिड इनपुट किस्में टीएफए और टीएफबी की एक जोड़ी का जवाब दिया(चित्र 8 ए)का उपयोग किया गया था। दोनों बंद (यानी, बंदी) और पर (यानी, uncaged) राज्यों में मैलाकाइट ग्रीन फ्लोरोसेंट इप्टामर के उत्पादन को मापने के द्वारा प्रतिलेखन गतिविधि की निगरानी की गई थी । इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के अंत में उत्पादित फ्लोरेसेंस सिग्नल की मात्रा चित्रा 8बीमें दिखाई जाती है, और वास्तविक समय की गतिज चित्र 8Cमें दिखाई जाती है। यहां, फ्लोरेसेंस सिग्नल में 336 गुना सक्रियण देखा जा सकता है, जो पॉलीमरेज गतिविधि के मजबूत नियंत्रण का प्रदर्शन करता है।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों आयतन इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों
ट्रिस 1 M 1.5 मिलीलीटर 50 मिलीमीटर
नैक 5 M 1.8 मिलीलीटर 300 मिलीमीटर
ग्लिसरोल 100 % 1.5 मिलीलीटर 5 %
बीएमई 14.2 M 10.5 माइक्रोल 5 मिलीमीटर
डीडीएच2ओ -- -- 25.2 मिलीलीटर -- --
अंतिम मात्रा -- -- 30 मिलीलीटर -- --

तालिका 1: लाइसिस/समतुल्य बफर फॉर्मूला ।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों आयतन इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों
ट्रिस 1 M 1.5 मिलीलीटर 50 मिलीमीटर
नैक 5 M 4.8 मिलीलीटर 800 मिलीमीटर
ग्लिसरोल 100 % 1.5 मिलीलीटर 5 %
बीएमई 14.2 M 7.0 माइक्रोल 5 मिलीमीटर
इमिडाजोल 2 M 200 माइक्रोल 20 मिलीमीटर
डीडीएच2ओ -- -- 22.2 मिलीलीटर -- --
अंतिम मात्रा -- -- 30 मिलीलीटर -- --

तालिका 2: बफर फॉर्मूला धोएं।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों आयतन इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों
ट्रिस 1 M 0.5 मिलीलीटर 50 मिलीमीटर
नैक 5 M 1.6 मिलीलीटर 800 मिलीमीटर
ग्लिसरोल 100 % 0.5 मिलीलीटर 5 %
बीएमई 14.2 M 3.5 माइक्रोल 5 मिलीमीटर
इमिडाजोल 2 M 1 मिलीलीटर 200 मिलीमीटर
डीडीएच2ओ -- -- 6.4 मिलीलीटर -- --
अंतिम मात्रा -- -- 10 मिलीलीटर -- --

तालिका 3: एल्यूशन बफर फॉर्मूला।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों आयतन इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों
ट्रिस 1 M 5 मिलीलीटर 100 मिलीमीटर
नैक 5 M 2 मिलीलीटर 200 मिलीमीटर
बीएमई 14.2 M 140.8 माइक्रोल 40 मिलीमीटर
ट्राइटन एक्स-100 100 % 100 माइक्रोल 0.2 %
एडटा 0.5 M 200 माइक्रोल 2 मिलीमीटर
डीडीएच2ओ -- -- 42.56 मिलीलीटर -- --
अंतिम मात्रा -- -- 50 मिलीलीटर -- --

तालिका 4: भंडारण बफर फार्मूला।

नमूना वर्णन नमूने का माइक्रोन लोडिंग डाई का माइक्रोल
1 प्रोटीन सीढ़ी 9 --
2 एफटी: फ्लो-थ्र 9 3
3 W1: 1 धोएं 9 3
4 W2: 2 धोएं 9 3
5 W3: 3 धोएं 9 3
6 E1: एल्यूशन 1 9 3
7 E2: एल्यूशन 2 9 3
8 E3: एल्यूशन 3 9 3
9 डे: डेसाल्टेड एल्यूशन 9 3

तालिका 5: बाएं से दाएं लेन के लिए एसडीएस-पेज सैंपल लोडिंग।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों अंतिम मात्रा इकाइयों
ट्रांसक्रिप्शन बफर 10 X 1 X 2 माइक्रोल
आरएनटीपी मिक्स 25 मिलीमीटर 0.5 मिलीमीटर 0.4 माइक्रोल
डीएनए टेम्पलेट 500 एनएम 125 एनएम 5 माइक्रोल
स्नैप T7 आरएनएपी 500 एनएम 50 एनएम 2 माइक्रोल
नाभिक मुक्त पानी -- -- -- -- 10.6 माइक्रोल
कुल मात्रा 20 माइक्रोल

तालिका 6: स्नैप T7 आरएनएपी (मास्टर मिक्स) के साथ इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन फॉर्मूला।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों अंतिम मात्रा इकाइयों
ट्रांसक्रिप्शन बफर 10 X 1 X 2 माइक्रोल
आरएनटीपी मिक्स 25 मिलीमीटर 0.5 मिलीमीटर 0.4 माइक्रोल
डीएनए टेम्पलेट 500 एनएम 125 एनएम 5 माइक्रोल
WT T7 आरएनएपी 500 एनएम 50 एनएम 2 माइक्रोल
नाभिक मुक्त पानी -- -- -- -- 10.6 माइक्रोल
कुल मात्रा 20 माइक्रोल

तालिका 7: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन फॉर्मूला विद वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटीई) T7 आरएनएपी (मास्टर मिक्स)।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों अंतिम मात्रा इकाइयों
ट्रांसक्रिप्शन बफर 10 X 1 X 2 माइक्रोल
आरएनटीपी मिक्स 25 मिलीमीटर 0.5 मिलीमीटर 0.4 माइक्रोल
डीएनए टेम्पलेट 500 एनएम 125 एनएम 5 माइक्रोल
नाभिक मुक्त पानी -- -- -- -- 12.6 माइक्रोल
कुल मात्रा 20 माइक्रोल

तालिका 8: पॉलीमरेज के बिना इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन फॉर्मूला; बफर-केवल नियंत्रण।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों आयतन इकाइयों आखिरी इकाइयों आखिरी इकाइयों अंतिम मात्रा इकाइयों
नाहको3 1 M 25 माइक्रोल 0.05 मिलीमीटर 1.25E-05 मोल 500 माइक्रोल
डीएमएसओ 100 % 284 माइक्रोल 56.8 % --- --- 500 माइक्रोल
ओलिगो 1 मिलीमीटर 125 माइक्रोल 0.25 माइक्रोन 6.25E-08 मोल 500 माइक्रोल
डीएमएसओ में बीजी-जीएलए-एनएचएस 50 मिलीमीटर 66 माइक्रोल 6.6 मिलीमीटर 1.65E-06 मोल 500 माइक्रोल

तालिका 9: ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के लिए बेंजिलगुआनाइन कंजुगेशन के लिए प्रतिक्रिया सूत्र।

जेल की मात्रा 10 एमएल
एक्रिलैमाइड एकाग्रता 18%
जी यूरिया 4.8
40% एक्रिलैमाइड का एमएल (19:1) 4.5
10x TBE की एमएल 1
डीएच2ओ का एमएल 2.8
तेमी का माइक्रोल 5
10% एपीएस का माइक्रोन 100

तालिका 10: 18% TBE-यूरिया डेनैचिंग पेज के लिए रिएक्शन फॉर्मूला।

नमूना वर्णन माइक्रोल नमूना माइक्रोल लोडिंग डाई
1 एल: अल्ट्रा कम रेंज सीढ़ी 3 --
2 S1: 100 एनएम ओलिगो 3 3
3 S2: 100 एनएम ओलिगो-बीजी 3 3
4 S3: 100 एनएम ओलिगो-बीजी + सेंट्री-स्पिन 3 3

तालिका 11: बाएं से दाएं गलियों के लिए पेज नमूना लोड करना।

नमूना एकाग्रता (एम) ओलिगो: आरएनएपी
1 2.50E-04 5:1
2 2.00E-04 4:1
3 1.50E-04 3:1
4 1.00E-04 2:1
5 5.00E-05 1:1
6 2.50E-05 1:2
7 1.68E-05 1:3
8 1.25E-05 1:4
9 1.00E-06 1:5

तालिका 12: स्नैप T7 आरएनएपी के लिए बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के विश्लेषणात्मक पैमाने पर युग्मन के लिए अभिवाक अनुपात।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन इकाई
स्नैप बफर 2 माइक्रोल
बीजी-ओलिगो 4 माइक्रोल
स्नैप-T7 आरएनएपी 4 माइक्रोल
कुल मात्रा 10 माइक्रोल

तालिका 13: स्नैप-टैग लेबलिंग रिएक्शन के लिए रिएक्शन फॉर्मूला ।

गली नमूना विवरण नमूना मात्रा (μL) स्नैप बफर वॉल्यूम (μL) लोडिंग डाई मात्रा (μL)
1 नमूना 1 2 4 2
2 नमूना 2 2 4 2
3 नमूना 3 2 4 2
4 नमूना 4 2 4 2
5 नमूना 5 2 4 2
6 नमूना 6 2 4 2
7 नमूना 7 2 4 2
8 नमूना 8 2 4 2
9 नमूना 9 2 4 2
10 आरएनएपी नियंत्रण 2 4 2
11 ओलिगो नियंत्रण 2 4 2
12 सीढी 4 -

तालिका 14: बीआईएस-ट्रिस पेज (4%-12%) जेल लेन लोडिंग नमूनों के लिए प्रतिक्रिया सूत्र।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों आयतन इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों अंतिम मात्रा इकाइयों
ट्रिस 1 M 50 माइक्रोल 50 मिलीमीटर 1000 माइक्रोल
नैक 5 M 100 माइक्रोल 0.5 M 1000 माइक्रोल
डीडीएच2ओ -- -- 850 माइक्रोल -- -- 1000 माइक्रोल

तालिका 15: एल्यूशन बफर (11.1) के लिए प्रतिक्रिया फार्मूला।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों पिपेट करने के लिए मात्रा इकाइयों
ट्रिस 1000 मिलीमीटर 25 मिलीमीटर 25 माइक्रोल
एडटा 500 मिलीमीटर 5 मिलीमीटर 10 माइक्रोल
एमजीसीएल 1000 मिलीमीटर 25 मिलीमीटर 25 माइक्रोल
डीडीएच2ओ -- -- -- -- 940 माइक्रोल

तालिका 16: 5x एनीलिंग बफर के लिए प्रतिक्रिया फार्मूला।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों वॉल्यूम टू पिपेट इकाइयों कुल रिएक्शन वॉल्यूम इकाइयों
ऐनीलिंग बफर 5 X 1 X 5 माइक्रोल 24 माइक्रोल
अर्थ 10 माइक्रोन 1 माइक्रोन 2.4 माइक्रोल 24 माइक्रोल
एंटीसेंस 10 माइक्रोन 1 माइक्रोन 2.4 माइक्रोल 24 माइक्रोल
डीडीएच2ओ -- -- -- -- 14.2 माइक्रोल 24 माइक्रोल

तालिका 17: प्रतिक्रिया सूत्र का उपयोग दो एसएसडीएनए टेम्पलेट्स (भावना और एंटीसेंस किस्में) के लिए किया जाता था।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता इकाइयों अंतिम एकाग्रता इकाइयों वॉल्यूम टू पिपेट इकाइयों कुल प्रतिक्रिया मात्रा इकाइयों
इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) बफर 10 X 1 X 2.5 माइक्रोल 25 माइक्रोल
आरएनटीपी मिक्स 25 मिलीमीटर 1 मिलीमीटर 1 माइक्रोल 25 माइक्रोल
मलाकाइट ग्रीन 1 मिलीमीटर 40 माइक्रोन 1 माइक्रोल 25 माइक्रोल
आरएनएपी 500 एनएम 50 एनएम 2.5 माइक्रोल 25 माइक्रोल
डीएनए टेम्पलेट 1000 एनएम 120 एनएम 3 माइक्रोल 25 माइक्रोल
डीडीएच2ओ -- -- -- -- 14 माइक्रोल 25 माइक्रोल

तालिका 18: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन फॉर्मूला (मास्टर मिक्स); आरएनएपी एकाग्रता भी शामिल है।

जेल वॉल्यूम 10 एमएल
एक्रिलैमाइड एकाग्रता 12%
जी यूरिया 4.8
एमएल 40% एक्रिलैमाइड (29:1) 3
एमएल 10x TBE 1
एमएल डीडीएच2ओ 4.3
माइक्रोन टेमी 5
माइक्रोल 10% एपीएस 100

तालिका 19: 12% TBE-यूरिया डेनैचिंग पेज के लिए रिएक्शन फॉर्मूला।

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Discussion

यह अध्ययन टी 7 आरएनए पॉलीमरेज की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए एक डीएनए नैनो-प्रेरित दृष्टिकोण को दर्शाता है, जो एक बीजी-कार्यात्मक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ एन-टर्मिनल स्नैप-टैग किए गए रिकॉम्बिनेंट टी 7 आरएनएपी को मिलाकर, जिसका उपयोग बाद में टीएमडीएसडी प्रतिक्रियाओं को प्रोग्राम करने के लिए किया गया था। डिजाइन के द्वारा, स्नैप-टैग को पॉलीमरेज के एन-टर्मिनस में तैनात किया गया था, क्योंकि जंगली प्रकार के T7 आरएनएपी के सी-टर्मिनस को प्रोटीन संरचना कोर के भीतर दफनाया जाता है और डीएनए टेम्पलेट28के साथ महत्वपूर्ण संपर्क बनाता है । पॉलीमरेज सी-टर्मिनस को संशोधित करने के पूर्व प्रयासों के परिणामस्वरूप एंजाइमेटिक गतिविधि का पूरा नुकसान हुआ है जब तक कि अन्य क्षतिपूर्ति उत्परिवर्तन शुरू नहीं किए जाते हैं। 29,30 इसके विपरीत, T7 RNAP के एन-टर्मिनल संलयन अच्छी तरह से सहन कर रहे हैं, हालांकि संलयन टैग का चुनाव बहुलक गतिविधि को प्रभावित कर सकता है। कैसे अलग टैग RNAP गतिविधि को प्रभावित व्यवस्थित रूप से निर्धारित नहीं किया गया है । स्नैप-टैग को इसलिए चुना गया क्योंकि यह कुशल और मजबूत है, जिससे प्रोटीन और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के स्टोइचियोमेट्रिक अनुपात के लिए मात्रात्मक टैगिंग की अनुमति दी गई थी। वैकल्पिक रूप से, अन्य कपलिंग रसायनों का उपयोग पॉलीमरेज से ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को जोड़ने के लिए किया जा सकता है, जैसे वाईबीबीआर31 टैग, सॉर्टज़ टैग32,और स्पाईटैग33,या फिर प्रतिक्रियाशील समूहों वाले अस्वाभाविक अमीनो एसिड की शुरूआत के माध्यम से। इन टैग के बीच आकार और अनुक्रम में अंतर परिणामी संलयन प्रोटीन की गतिविधि को भी प्रभावित कर सकता है, और साइट-विशिष्ट आरएनएपी टैगिंग के लिए इष्टतम विकल्प भविष्य की जांच के गुण हैं। अंत में, आरएनएपी को सीमित किए गए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड की लंबाई को 30 एनटी < तक सीमित करने की सिफारिश की जाती है। यह T7 आरएनएपी के डीएनए बाध्यकारी डोमेन के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के बीच गैर-विशिष्ट इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन को कम करने और आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी द्वारा ओलिगोन्यूक्लियोटाइड टेथेड आरएनएपी के शुद्धिकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

यहां वर्णित प्रस्तावित प्रौद्योगिकी के लिए एक पुनर्संयोजन स्नैप T7 RNAP की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है, और संश्लेषण प्रक्रिया के दौरान दो महत्वपूर्ण कदम हैं जो प्रोटीन उत्पाद की समग्र उपज को प्रभावित करते हैं । सबसे पहले, सेल लाइसिस के लिए सोनीशन का उपयोग नमूना (धारा 4) को गर्म कर सकता है। प्रोटीन को गर्मी से बाहर निकालने के बिना कुशल सेल लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए, सेल के नमूने को पूरे सोनीशन में बर्फ पर रखा जाना चाहिए और प्रत्येक नमूने के बीच में निगरानी की गई सोनीशन जांच का तापमान होना चाहिए। एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम बफर-एक्सचेंज और स्नैप T7 आरएनएपी की एकाग्रता है, जो उनके टैग शुद्धिकरण (चरण 4.11.2) के बाद है। प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने के लिए अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाई की झिल्ली को धीरे-धीरे धोना महत्वपूर्ण है, जिससे समग्र उपज और प्रोटीन कार्यक्षमता में कमी आएगी।

सिद्धांत रूप में, स्नैप-टैग के साथ बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रतिक्रिया 1:1 मोलर अनुपात में मात्रात्मक है। हालांकि, सामग्री का एक बड़ा बैच तैयार करने से पहले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड-टू-पॉलीमेरेज स्टोइकिओमेट्रिक अनुपात की एक श्रृंखला का परीक्षण किया जाना चाहिए। इसका कारण यह है कि प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान गलत हो सकता है। इस कदम के इष्टतम युग्मन अनुपात की पहचान करने के लिए एक निरंतर प्रोटीन एकाग्रता के संबंध में बीजी-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के विभिन्न कमजोर पड़ने पर युग्मन प्रतिक्रिया के एसडीएस-पेज प्रदर्शन की आवश्यकता हो सकती है । पृष्ठ विश्लेषण के दौरान, एक ही जेल को दो दागों के साथ क्रमिक रूप से दाग दिया जा सकता है: एक न्यूक्लिक-एसिड दाग जिसके बाद एक कूमासी ब्लू प्रोटीन दाग होता है। न्यूक्लिक-एसिड दाग के साथ धुंधला होने से पहले जेल से एसडीएस को अच्छी तरह से धोना महत्वपूर्ण है। इसका कारण यह है कि एसडीएस जेल में डाई को ट्रैप करेगा, जिससे उच्च पृष्ठभूमि का संकेत मिलेगा। इसके अलावा, न्यूक्लिक एसिड दाग को कूमासी ब्लू प्रोटीन दाग से पहले किया जाना चाहिए।

हालांकि यह प्रस्तावित प्रणाली प्रोटीन आधारित ट्रांसक्रिप्शनल सर्किट की कार्यक्षमता के साथ डीएनए सर्किट की स्केलेबिलिटी को एक साथ लाती है, यह ट्रांसक्रिप्शनल सर्किट में देखी गई सीमाओं का भी परिचय देती है। डीएनए कंप्यूटर के कई फायदों में से एक वातावरण की एक किस्म में न्यूक्लिक एसिड की स्थिरता है। पॉलीमरेस के अलावा, सीमित बहुलक प्रणाली को विकृति को रोकने के लिए विशिष्ट शर्तों के तहत संग्रहीत किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कंप्यूटिंग विशिष्ट बफर स्थितियों के साथ एक वातावरण में होना चाहिए जो प्रतिलेखन के लिए अनुमति देते हैं। यद्यपि इस प्रदर्शन में T7 बैक्टीरियोफेज से आरएनए पॉलीमरेज का उपयोग किया जाता है, लेकिन इस सीमा को दरकिनार करने के लिए अधिक आवेदन-उपयुक्त शर्तों के साथ एक और आरएनए पॉलीमरेज का उपयोग किया जा सकता है।

परिणाम बताते हैं कि इस सीमित बहुलक प्रणाली को न्यूक्लिक एसिड "ट्रांसक्रिप्शन कारकों" का उपयोग करके बंद (उदाहरण के लिए, बंदी) और ऑन (यानी, अनकेजेड) राज्यों के बीच टॉगल किया जा सकता है। प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए डीएनए का उपयोग करने से बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्शनल सर्किट डिजाइन करना संभव हो जाता है, जिसमें बहु-परत सिग्नल कैस्केड और फीडबैक का निर्माण शामिल है। एक अन्य विशेषता सर्किट के माध्यम से प्राप्त या पारित इनपुट संकेतों का आत्म-प्रवर्धन है, एक सक्रिय बहुलक के रूप में जो टेम्पलेट को संकरित कर चुका है, तब तक इसकी ट्रांसक्रिप्ट की अधिक प्रतियां तैयार करना जारी रखेगा जब तक कि इसे बंद नहीं कर दिया जाता। कम एकाग्रता वाले आदानों के लिए सर्किट प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए इस संकेत प्रवर्धन तंत्र का दोहन किया जा सकता है। अंत में, इस बिल्डिंग ब्लॉक का उपयोग डिजिटल तर्कों की एक श्रृंखला को लागू करने के लिए किया जा सकता है। यह अध्ययन टेम्पलेट्स को डिजाइन करके "एंड लॉजिक" के माध्यम से टेम्पलेट्स की सक्रियता को दर्शाता है जिसे दो न्यूक्लिक एसिड किस्में द्वारा सक्रिय किया जाना चाहिए। इसी तरह, "या तर्क" एक डीएनए टेम्पलेट केवल कतरा बी के लिए उत्तरदायी बनाने के द्वारा डिजाइन किया जा सकता है, और एक "एडाप्टर" मध्यवर्ती है कि कतरा बी की अभी तक एक और प्रतिलिपि के उत्पादन के बदले में कतरा एक कतरा शुरू । इस मामले में, प्रतिक्रिया में इनपुट के रूप में या तो स्ट्रैंड ए या बी शुरू करने से लक्ष्य डीएनए टेम्पलेट के प्रतिलेखन को ट्रिगर किया जाएगा। पैमाने पर विभिन्न प्रकार के सर्किट व्यवहारों को तर्कसंगत रूप से डिजाइन करने की क्षमता रोग का पता लगाने, पोर्टेबल बायोमैन्यूफैक्चरिंग, साथ ही आणविक डेटा प्रसंस्करण और भंडारण में उभरते अनुप्रयोगों के लिए जटिल आणविक कंप्यूटिंग एल्गोरिदम के कार्यान्वयन को सक्षम कर सकती है।

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Disclosures

किसी भी लेखक द्वारा घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

L.Y.T.C अनुसंधान कोष में नई सीमाओं से उदार समर्थन स्वीकार-अंवेषण (NFRF-E), कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) डिस्कवरी ग्रांट, और डिजाइन पहल है, जो कनाडा के पहले अनुसंधान उत्कृष्टता कोष (CFREF) से धन प्राप्त द्वारा टोरंटो चिकित्सा विश्वविद्यालय ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) BioShop TWN510.5
0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio Basic SD8135
10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) Bio Basic PD0435 Tablets used to make 10 mM buffer
10% ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich A3678-100G
100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC910008
100% acetone Fisher Chemical A18P4
100% ethanol (EtOH) House Brand 39752-P016-EAAN
10x in vitro transcription (IVT) buffer New England Biolabs B9012
10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Bio Basic A0026
1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I5502-1G
1M sodium bicarbonate buffer Sigma Aldrich S6014-500G
1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma Aldrich 648311-1KG
1X Tris-EDTA (TE) buffer ThermoFisher 12090015
2M imidazole Sigma Aldrich 56750-100G
2-mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich M3148
3M sodium acetate Bio Basic SRB1611
40% acrylamide (19:1) Bio Basic A00062
4x LDS protein sample loading buffer Fisher Scientific NP0007
5M sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
5mM dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 43815-1G
6x gel loading dye New England Biolabs B7024S
agarose B powder Bio Basic AB0014
BG-GLA-NHS New England Biolabs S9151S
BL21 competent E. coli Addgene C2530H
BLUeye prestained protein ladder FroggaBio PM007-0500
bromophenol blue Bio Basic BDB0001
coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) ThermoFisher LC6060
cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) Fisher Scientific S11494
cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) Fisher Scientific S33102
dry dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D12345
formamide Sigma Aldrich F9037-100ML
glycerol Bio Basic GB0232
kanamycin sulfate BioShop KAN201.5
lysogeny broth Sigma Aldrich L2542-500ML
malachite green oxalate Sigma Aldrich 2437-29-8
N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Sigma Aldrich T9281-25ML
NuPAGE MES SDS running buffer (20x) Fisher Scientific LSNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well Life Technologies NP0322BOX
oligonucleotide (cage antisense) IDT N/A TATAGTGAGTCGTATTAATTTG
oligonucleotide (cage sense) IDT N/A TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA
TTAATACGACTCACTATA
oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) IDT N/A GGATCCATTCGTTACCTGGCT
CTCGCCAGTCGGGATCCTATA
GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT
TATCGCCGTAGTTGGTGTACT
oligonucleotide (malachite green aptamer sense) IDT N/A TAATACGACTCACTATAGGATC
CCGACTGGCGAGAGCCAGGT
AACGAATGGATCC
oligonucleotide (Transcription Factor A) IDT N/A AGTACACCAACTACGAGTGAG
oligonucleotide (Transcription Factor B) IDT N/A TCAGTCACCTATCTGGCGATAA
TGGAACTG
oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) IDT N/A GCTACTCACTCAGATAGGTGAC
TGA/3AmMO/
Pierce strong ion exchange spin columns Fisher Scientific 90008
plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes Genscript N/A custom gene insert
protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) Fisher Scientific 88226
rNTP mix New England Biolabs N0466S
Roche mini quick DNA spin column Sigma Aldrich 11814419001
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML
Ultra Low Range DNA ladder Fisher Scientific 10597012
urea BioShop URE001.1

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