使用多柱板适配器的经济性和多功能性高通量蛋白质净化系统
Summary
多柱板适配器允许色谱柱与多井收集板接口，用于平行亲和力或离子交换纯化，提供经济的高通量蛋白质纯化方法。它可以通过负担得起的仪器在重力或真空下产生毫克蛋白质。
Abstract
蛋白质纯化是蛋白质结构和功能研究的必要条件，通常与生物物理技术相结合使用。它也是开发新疗法的关键组成部分。功能蛋白质组学的不断发展时代正在推动对高通量蛋白质纯化的需求，并改进了技术来促进这一需求。据推测，多柱板适配器（MCPA）可以将不同脂质的多个色谱柱与多井板对接，进行平行净化。这种方法提供了一种经济且多才多艺的蛋白质纯化方法，可在重力或真空下使用，与自动化系统的速度相媲美。MCPA可以用来通过一种经济实惠且省时的方法回收蛋白质的毫克产量，用于后续的定型和分析。MCPA 已用于 SH3 域的高吞吐量亲和力纯化。离子交换也通过MCPA证明净化蛋白质后Ni-NTA亲和色谱，表明该系统如何可以适应其他纯化类型。由于其设置具有多个列，参数的单独自定义可以在同一纯化中进行，目前基于板的方法无法实现。
Introduction
蛋白质纯化技术，以达到毫克的纯化蛋白质的数量是必不可少的，他们的特征和分析，特别是生物物理方法，如NMR。蛋白质纯化也是其他研究领域的核心，如药物发现过程和蛋白质-蛋白质相互作用研究：然而，实现如此数量的纯蛋白质可以成为这些技术的瓶颈1，2，3。蛋白质纯化的主要方法是色谱法，它包括各种依靠蛋白质的个体特征及其标签的方法。在亲和色谱中，蛋白质有一个额外的蛋白质或肽图案，作为一个标签，对色谱树脂4上的某一基质有亲和力。最常见的亲和力方法是使用他标记的蛋白质固定金属亲和力色谱 （IMAC），而另一种流行的方法是离子交换色谱，根据蛋白质的电荷分离蛋白质。对于最高的纯度，亲和色谱和离子交换的组合经常一起使用，通常需要昂贵的实验室设备来获得高通量。
功能蛋白质组学时代的发展正在推动对高通量技术的需求，以纯化不是单一的蛋白质进行特定分析，而是同时大量蛋白质进行综合分析和基因组广泛研究。固定金属亲和色谱 （IMAC） 是高通量蛋白质纯化6、7最广泛使用的方法之一，但其自动化系统对于较小的实验室8来说成本高昂且负担不起。目前可用的更经济实惠的基于板材的替代品采用无障碍实验室设备，如真空。虽然这些方法成功地提高了净化速度，但它只能在较小的规模上实现高通量纯化，只能在微克范围内产生蛋白质。这些限制意味着，在生物物理技术9之前，不能使用预包装的96井过滤板（例如，来自Ge医疗保健公司现在拥有Cytiva）。重力色谱是最经济高效的净化方法：但是，设置多个列不方便，并且可能容易出现多种蛋白质的错误。
多柱板适配器 （MCPA） 已开发和证明成功和方便地运行平行亲和色谱列一次净化他的标签酵母 SH3 域10.MCPA 提供一种经济高效的高通量净化方法，不依赖于昂贵的仪器仪表。其灵活的设计可以通过重力或真空歧管下的多个亲和力色谱柱有效纯化毫克蛋白质。此外，树脂类型、体积和其他参数可用于每个列进行调整，以便更快地优化。这项研究表明，MCPA 的离子交换色谱可用于 MCPA 与亲和力色谱相结合，以提高 Abp1 SH3 域的纯化。此外，使用这些方法可以并行分离多达 24 种不同的蛋白质。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方法是稳健和简单的使用相对缺乏经验的蛋白质生物化学家，但也有一些考虑要记住。
小心过度填充收集板
48 井收集板本身每口井仅容纳 5 mL，而每口 96 井仅持有 2 mL。在添加缓冲区并在列中运行样品时，需要牢记这一点，因为存在油井过多的风险。特别是，在将较大的样品转移到色谱柱进行净化时，需要小心谨慎。在超标超标的情况下?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所（IDeA）以P20GM103451的资助和利物浦大学的内部研究补助金支持的研究。
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
