Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi
Summary
Çok sütunlu plaka adaptörü, kromatografi sütunlarının paralel benzeşim veya iyon değişimi saflaştırması için çok kuyulu toplama plakalarıyla arayüzlenmesini sağlayarak ekonomik yüksek verimli protein saflaştırma yöntemi sağlar. Uygun fiyatlı enstrümantasyon yoluyla miligram protein miktarı sağlayan yerçekimi veya vakum altında kullanılabilir.
Abstract
Protein saflaştırma, protein yapısı ve fonksiyonunun incelenmesi için zorunludur ve genellikle biyofizik tekniklerle birlikte kullanılır. Ayrıca yeni terapötiklerin geliştirilmesinde önemli bir bileşendir. Fonksiyonel proteomiklerin gelişen çağı, bunu kolaylaştırmak için yüksek verimli protein saflaştırma ve gelişmiş tekniklere olan talebi körüklüyor. Çok sütunlu plaka adaptörünün (MCPA) paralel saflaştırma için çok kuyulu plakalarla farklı reçinelerin birden fazla kromatografi sütununu arayüzleyebileceği varsayıldı. Bu yöntem, otomatik bir sistemin hızına rakip olarak yerçekimi veya vakum altında kullanılabilen ekonomik ve çok yönlü bir protein saflaştırma yöntemi sunar. MCPA, sonraki karakterizasyon ve analiz için uygun fiyatlı ve zaman verimli bir yöntemle miligram protein verimini geri kazanmak için kullanılabilir. MCPA, SH3 etki alanlarının yüksek verimli benzeşimlilik saflaştırılması için kullanılmıştır. İyon değişimi, Ni-NTA benzeşim kromatografisi sonrası proteini saflaştırmak için MCPA aracılığıyla da gösterilmiştir ve bu sistemin diğer saflaştırma türlerine nasıl uyarlanabilebileceğini gösterir. Birden fazla sütunla kurulumu nedeniyle, parametrelerin bireysel olarak özelleştirilmesi, mevcut plaka tabanlı yöntemlerle elde edilemeyen aynı saflaştırmada yapılabilir.
Introduction
Miligram miktarlarda saflaştırılmış protein elde etmek için protein saflaştırma teknikleri, özellikle NMR gibi biyofiziksel yöntemler için karakterizasyon ve analizleri için zorunludur. Protein saflaştırma, ilaç keşif süreçleri ve protein-protein etkileşim çalışmaları gibi diğer çalışma alanlarında da merkezidir; bununla birlikte, bu miktarda saf protein elde etmek, bu teknikler için bir darboğazhalinegelebilir 1,2,3. Protein saflaştırmanın temel yöntemi, proteinlerin ve etiketlerinin bireysel özelliklerine dayanan çeşitli yöntemler içeren kromatografidir. Benzeşim kromatografisinde, proteinler kromatografi reçinesi üzerinde belirli bir substrata benzeyen bir etiket olarak çalışan ek bir protein veya peptit motifine sahiptir4. En yaygın benzeşim yöntemi, His etiketli proteinleri kullanan hareketsiz metal benzeşim kromatografisidir (IMAC), bir diğer popüler yöntem ise proteinleri yüklerine göre ayıran iyon değişimi kromatografisidir. En yüksek saflık için, benzeşim kromatografisi ve iyon değişiminin bir kombinasyonu sıklıkla birlikte kullanılır ve genellikle yüksek verim için pahalı laboratuvar ekipmanı gerektirir.
Fonksiyonel proteomiklerin gelişen çağı, belirli analizler için tekil proteinleri değil, kapsamlı analiz ve genom geniş çalışmaları için aynı anda çok sayıda proteini arındırmak için yüksek verimli tekniklere olan talebi körüklüyor5. Hareketsiz metal benzeşimi kromatografisi (IMAC), yüksek verimli protein saflaştırma6,7 için en yaygın kullanılan yöntemlerdenbiridir,ancak otomatik sistemleri daha küçük laboratuvarlar için maliyetli ve uygun değildir8. Şu anda mevcut olan daha uygun fiyatlı plaka tabanlı alternatifler, vakum gibi erişilebilir laboratuvar tabanlı ekipmanların kullanımını kullanır. Bu yöntemler saflaştırma hızını artırmada başarılı olsa da, sadece daha küçük ölçekte yüksek verimli saflaştırma elde edebilir, sadece mikrogram aralığında protein verebilir. Bu sınırlamalar, önceden paketlenmiş 96 kuyu filtre plakasının (örneğin, şu anda Cytiva’ya ait olan GE Healthcare’den) biyofizik tekniklerden önce kullanılamayacağı anlamına gelir9. Yerçekimi kromatografisi en uygun maliyetli saflaştırma yöntemidir; ancak, birden fazla sütun kurmak sakıncalı ve birden fazla protein için hataya eğilimli olabilir.
Çok sütunlu bir plaka adaptörü (MCPA) geliştirilmiştir ve etiketli maya SH3 etki alanlarını arındırmak için paralel benzeşim kromatografi sütunlarını aynı anda başarılı ve rahat bir şekilde çalıştırdığı kanıtlanmıştır10. MCPA, maliyetli enstrümantasyona bağlı olmayan uygun maliyetli yüksek verimli saflaştırma yöntemi sunar. Esnek tasarımı, miligram proteini yerçekimi veya vakum manifoldu altında birden fazla benzeşim kromatografi kolonu ile etkili bir şekilde saflaştırabilir. Ayrıca, daha hızlı iyileştirme için her bir sütun için reçine türü, hacmi ve diğer parametreler ayarlanabilir. Bu çalışma, MCPA tarafından iyon değişim kromatografisinin, ABP1 SH3 alanının saflaştırılmasını geliştirmek için MCPA tarafından benzeşim kromatografisi ile birlikte kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, bu yöntemler kullanılarak paralel olarak 24 farklı protein ayrılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yöntem, nispeten deneyimsiz protein biyokimyacıları için sağlam ve kullanımı kolaydır, ancak akılda tutulması gereken birkaç husus vardır.
Toplama plakalarını aşırı doldurma konusunda dikkatli olun
48 kuyulu toplama plakasının kendisi kuyu başına sadece 5 mL tutarken, her 96 kuyu sadece 2 mL tutar. Kuyuları aşırı doldurma riski olduğundan, sütun boyunca tampon eklerken ve örnek çalıştırırken bu akılda tutulmalıdır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırmalar, P20GM103451 hibe numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü’nden Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ve Liverpool Üniversitesi’nden bir iç araştırma hibesi ile desteklendi.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
