מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת רב-עמודות
Summary
מתאם צלחת מרובה עמודות מאפשר לממשק עמודות כרומטוגרפיה עם לוחות איסוף מרובי בארות לזיקה מקבילה או לטיהור חילופי יון המספקים שיטת טיהור חלבון חסכונית בעלת תפוקה גבוהה. זה יכול לשמש תחת כוח הכבידה או ואקום מניב כמויות מיליגרם של חלבון באמצעות מכשור סביר.
Abstract
טיהור חלבונים הוא הכרחי לחקר מבנה החלבון ותפקודו ומשמש בדרך כלל בשילוב עם טכניקות ביופיזיות. זהו גם מרכיב מרכזי בפיתוח טיפולים חדשים. העידן המתפתח של פרוטאומיקה תפקודית מתדלק את הביקוש לטיהור חלבונים בתפוקה גבוהה וטכניקות משופרות כדי להקל על כך. ההשערה הייתה כי מתאם לוחות מרובה עמודות (MCPA) יכול לממשק עמודות כרומטוגרפיה מרובות של שרפים שונים עם לוחות רב-באר לטיהור מקביל. שיטה זו מציעה שיטה חסכונית ורב-תכליתית של טיהור חלבונים שניתן להשתמש בה תחת כוח משיכה או ואקום, המתחרה במהירות של מערכת אוטומטית. MCPA יכול לשמש כדי לשחזר תפוקות מיליגרם של חלבון על ידי שיטה סבירה ויעילה בזמן עבור אפיון וניתוח הבאים. ה- MCPA שימש לטיהור זיקה בתפוקה גבוהה של תחומי SH3. חילופי יון הוכח גם באמצעות MCPA כדי לטהר חלבון לאחר כרומטוגרפיה זיקה Ni-NTA, המציין כיצד מערכת זו יכולה להיות מותאמת לסוגי טיהור אחרים. בשל ההתקנה שלה עם עמודות מרובות, התאמה אישית אישית של פרמטרים יכול להתבצע באותו טיהור, בלתי ניתן להשגה על ידי שיטות מבוססות צלחת הנוכחי.
Introduction
טכניקות טיהור חלבונים להשגת כמויות מיליגרם של חלבונים מטוהרים הן הכרחיות לאפיון וניתוח שלהם, במיוחד עבור שיטות ביופיזיות כגון NMR. טיהור חלבונים הוא גם מרכזי בתחומים אחרים של מחקר כגון תהליכי גילוי תרופות ומחקרי אינטראקציה בין חלבונים לחלבון; עם זאת, השגת כמויות כאלה של חלבון טהור יכול להיות צוואר בקבוק עבור טכניקות אלה1,2,3. השיטה העיקרית לטיהור חלבונים היא כרומטוגרפיה, הכוללת מגוון שיטות המסתמכות על המאפיינים האישיים של חלבונים ותגיהם. ב כרומטוגרפיה זיקה, חלבונים יש חלבון נוסף או מוטיב פפטיד שעובד כתג שיש לו זיקה מצע מסוים על משרף כרומטוגרפיה4. שיטת הזיקה הנפוצה ביותר היא כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת (IMAC) באמצעות חלבונים מתויגים על ידי His, ואילו שיטה פופולרית נוספת היא כרומטוגרפיה של חילופי יון המפרידה חלבונים על סמך המטען שלהם. עבור הטוהר הגבוה ביותר, שילוב של כרומטוגרפיה זיקה והחלפת יון משמש לעתים קרובות יחד, בדרך כלל דורש ציוד מעבדה יקר עבור תפוקה גבוהה.
העידן המתפתח של פרוטאומיקה תפקודית מתדלק את הביקוש לטכניקות תפוקה גבוהה לטיהור חלבונים לא ייחודיים לניתוח ספציפי אלא למספר רב של חלבונים בו זמנית לניתוח מקיף ומחקרים רחבים בגנום5. כרומטוגרפיה של זיקה מתכת משותקת (IMAC) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לטיהור חלבונים בתפוקה גבוהה6,7 ובכל זאת המערכות האוטומטיות שלה יקרות ובלתי ניתנות להשגה עבור מעבדות קטנות יותר8. החלופות הזולות יותר המבוססות על לוחית רישוי הזמינות כיום משתמשות בשימוש בציוד נגיש מבוסס מעבדה, כגון ואקום. למרות ששיטות אלה מצליחות לשפר את מהירות הטיהור, הן יכולות להשיג טיהור בעל תפוקה גבוהה רק בקנה מידה קטן יותר, רק מניב חלבון בטווח המיקרוגרם. מגבלות אלה אומרות כי ארוז מראש 96 גם מסנן צלחות (למשל, מ GE Healthcare עכשיו בבעלות Cytiva) לא ניתן להשתמש לפני טכניקות ביופיזיות9. כרומטוגרפיית הכבידה היא שיטת הטיהור החסכונית ביותר; עם זאת, הגדרת עמודות מרובות אינה נוחה ויכולה להיות מועדת לשגיאה עבור חלבונים מרובים.
מתאם צלחת מרובה עמודות (MCPA) פותח והוכח בהצלחה ובנוחות להפעיל עמודות כרומטוגרפיה זיקה מקבילה בבת אחת כדי לטהר שלו מתויג שמרים SH3 תחומים10. ה- MCPA מציע שיטת טיהור חסכונית בעלת תפוקה גבוהה שאינה תלויה במכשור יקר. העיצוב הגמיש שלו יכול לטהר ביעילות מיליגרם של חלבון על ידי עמודי כרומטוגרפיה זיקה מרובים תחת כוח הכבידה או סעפת ואקום. יתר על כן, ניתן להתאים סוג, אמצעי אחסון ופרמטרים אחרים עבור כל עמודה בודדת למיטוב מהיר יותר. מחקר זה מדגים כי כרומטוגרפיה חילופי יון על ידי MCPA ניתן להשתמש בשילוב עם כרומטוגרפיה זיקה על ידי MCPA כדי לשפר את הטיהור של התחום Abp1 SH3. בנוסף, ניתן להפריד עד 24 חלבונים שונים במקביל בשיטות אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה היא חזקה ופשוטה לשימוש עבור ביוכימאים חלבון לא מנוסה יחסית, עם זאת יש כמה שיקולים לזכור.
זהירות לגבי מילוי יתר של צלחות איסוף
צלחת אוסף 48 באר עצמו מחזיק רק 5 מ”ל לבאר בעוד כל 96-באר מחזיק רק 2 מ”ל. יש לזכור זאת בעת הוספת מאגר והפעלת מדגם דרך העמודה מכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי פרס פיתוח מוסדי (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר המענק P20GM103451 ומענק מחקר פנימי מאוניברסיטת ליברפול.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
