Экономичная и универсальная высокопроизводительная система очистки белка с использованием многоколоночного пластинчатого адаптера
Summary
Адаптер пластин с несколькими колонками позволяет сопроцессировать колонны хроматографии с многопробойными коллекторными пластинами для параллельной аффинной или ионообменной очистки, обеспечивая экономичный высокопроизводительный метод очистки белка. Его можно использовать под действием силы тяжести или вакуума, давая миллиграммовые количества белка с помощью доступных приборов.
Abstract
Очистка белка необходима для изучения структуры и функции белка и обычно используется в сочетании с биофизическими методами. Это также ключевой компонент в разработке новых терапевтических средств. Развивающаяся эра функциональной протеомики подпитывает спрос на высокопроизводительную очистку белка и улучшенные методы, облегчающие это. Было выдвинуто гипотеза, что многоколонный пластинчатый адаптер (MCPA) может соприкосноветь несколько хроматографических колонок различных смол с многопробойными пластинами для параллельной очистки. Этот метод предлагает экономичный и универсальный метод очистки белка, который может использоваться под действием силы тяжести или вакуума, соперничая по скорости с автоматизированной системой. MCPA может быть использован для восстановления миллиграммовых выходов белка доступным и эффективным по времени методом для последующей характеристики и анализа. MCPA используется для высокопроизводительной аффинной очистки доменов SH3. Ионный обмен также был продемонстрирован с помощью MCPA для очистки белка после Ni-NTA аффинной хроматографии, указывая, как эта система может быть адаптирована к другим типам очистки. Благодаря его установке с несколькими колоннами, индивидуальная настройка параметров может быть выполнена в той же очистке, недостижимой современными методами на основе пластин.
Introduction
Методы очистки белков для достижения миллиграммовых количеств очищенных белков необходимы для их характеристики и анализа, особенно для биофизических методов, таких как ЯМР. Очистка белка также занимает центральное место в других областях исследований, таких как процессы открытия лекарств и исследования белково-белкового взаимодействия; однако достижение таких количеств чистого белка может стать узким местом для этих методик1,2,3. Основным методом очистки белка является хроматография, которая включает в себя множество методов, которые опираются на индивидуальные особенности белков и их метки. В аффинной хроматографии белки имеют дополнительный белковый или пептидный мотив, который работает как метка, имея сродство к определенному субстрату на хроматографической смоле4. Наиболее распространенным методом сродства является иммобилизованная аффинная хроматография металлов (IMAC) с использованием помеченных His белков, тогда как другим популярным методом является ионообменная хроматография, которая разделяет белки на основе их заряда. Для обеспечения высочайшей чистоты сочетание аффинной хроматографии и ионного обмена часто используется вместе, что обычно требует дорогостоящего лабораторного оборудования для высокой пропускной способности.
Развивающаяся эра функциональной протеомики подпитывает спрос на высокопроизводительные методы очистки не единичных белков для специфического анализа, а большого количества белков одновременно для всестороннего анализа и исследований генома5. Иммобилизованная аффинная хроматография металлов (IMAC) является одним из наиболее широко используемых методов высокопроизводительной очистки белка6,7, но ее автоматизированные системы являются дорогостоящими и недоступными для небольших лабораторий8. Более доступные альтернативы на основе пластин, которые в настоящее время доступны, используют доступное лабораторное оборудование, такое как вакуум. Хотя эти методы успешны в улучшении скорости очистки, он может достичь высокой пропускной способности очистки только в меньших масштабах, давая только белок в диапазоне микрограммов. Эти ограничения означают, что предварительно упакованные 96 фильтрующие пластины (например, от GE Healthcare, в настоящее время принадлежащей Cytiva) не могут быть использованы до биофизических методов9. Гравитационная хроматография является наиболее экономичным методом очистки; однако настройка нескольких столбцов неудобна и может быть подвержена ошибкам для нескольких белков.
Был разработан и доказано, что многоколонный пластинчатый адаптер (MCPA) успешно и удобно запускает параллельные сродственные хроматографические колонки одновременно для очистки помеченных His дрожжевых доменов SH310. MCPA предлагает экономичный высокопроизводительный метод очистки, который не зависит от дорогостоящих приборов. Его гибкая конструкция может эффективно очищать миллиграммы белка с помощью нескольких аффинных хроматографических колонок под действием силы тяжести или вакуума. Кроме того, тип смолы, объем и другие параметры могут быть скорректированы для каждого отдельного столбца для более быстрой оптимизации. Это исследование демонстрирует, что ионообменная хроматография MCPA может быть использована в сочетании с аффинной хроматографией MCPA для усиления очистки домена Abp1 SH3. Кроме того, с помощью этих методов можно параллельно разделить до 24 различных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод надежен и прост в использовании для относительно неопытных биохимиков белка, однако есть несколько соображений, которые следует иметь в виду.
Предостережение при переполнении коллекционных пластин
Сама коллекторная плита из 48 скважин вме?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны премией за институциональное развитие (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером гранта P20GM103451 и внутренним исследовательским грантом От Ливерпульского университета.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
