다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하는 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정화 시스템
Summary
다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하면 크롬노그래피 컬럼을 병렬 친화성 또는 이온 교환 정제를 위한 다중 웰 컬렉션 플레이트와 인터페이스하여 경제적인 높은 처리량 단백질 정제 방법을 제공합니다. 그것은 중력 또는 진공 산출 밀리 그램 양의 단백질을 통해 저렴 한 계측을 통해 사용할 수 있습니다.
Abstract
단백질 정제는 단백질 구조 및 기능에 대한 연구에 필수적이며 일반적으로 생물 물리학 기술과 함께 사용됩니다. 그것은 또한 새로운 치료의 개발에 핵심 구성 요소. 기능성 프로테오믹스의 진화하는 시대는 이를 용이하게 하기 위해 고처리량 단백질 정제 및 개선된 기술에 대한 수요를 촉진하고 있다. 다중 컬럼 플레이트 어댑터(MCPA)가 병렬 정제를 위해 다중 웰 플레이트와 다른 수지의 여러 크로마토그래피 컬럼을 인터페이스할 수 있다고 가설이 있었습니다. 이 방법은 자동화 된 시스템의 속도에 필적하는 중력 이나 진공 하에서 사용할 수있는 경제적이고 다양한 단백질 정제 방법을 제공합니다. MCPA는 후속 특성화 및 분석을 위한 저렴하고 시간 효율적인 방법으로 단백질의 밀리그램 수율을 회수하는 데 사용할 수 있습니다. MCPA는 SH3 도메인의 높은 처리량 선호도 정화에 사용되었습니다. 이온 교환은 또한 단백질 포스트 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 정화하기 위해 MCPA를 통해 입증되었으며, 이는 이 시스템이 다른 정제 유형에 어떻게 적응될 수 있는지를 나타냅니다. 여러 열로 설정하기 때문에 파라미터의 개별 사용자 지정은 현재 플레이트 기반 방법에 의해 달성 할 수없는 동일한 정제로 이루어질 수 있습니다.
Introduction
정제된 단백질의 밀리그램 양을 달성하는 단백질 정제 기술은 특히 NMR과 같은 생물 물리학 적 방법에 대한 특성화 및 분석에 필수적입니다. 단백질 정제는 또한 약물 발견 과정 및 단백질 단백질 상호 작용 연구와 같은 연구의 다른 영역에 걸쳐 중심; 그러나, 이러한 양의 순수 단백질을 달성하는 것은 이러한 기술에 대한 병목 현상이 될 수 있다1,2,3. 단백질 정화를 위한 주요 방법은 단백질과 그들의 꼬리표의 개별적인 특성에 의존하는 다양한 방법을 포함하는 크로마토그래피입니다. 친화도 크로마토그래피에서, 단백질은 크로마토그래피 수지4에특정 기판에 대한 친화력을 갖는 태그로 작동하는 추가 단백질 또는 펩티드 모티프를 가지고 있다. 가장 일반적인 친화성 방법은 그의 태그 단백질을 사용하여 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)이며, 또 다른 인기있는 방법은 충전에 따라 단백질을 분리하는 이온 교환 크로마토그래피입니다. 최고 순도를 위해 친화도 크로마토그래피와 이온 교환의 조합이 자주 함께 사용되며 일반적으로 고처리량에 대한 고가의 실험실 장비가 필요합니다.
기능성 프로테오믹스의 진화하는 시대는 특정 분석을 위한 단수 단백질이 아니라 포괄적인 분석 및 게놈 와이드연구를위해 동시에 많은 수의 단백질을 정화하기 위한 고처리량 기술에 대한 수요를 촉진하고 있다 5. 고정금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)는 고처리량 단백질 정제6,7, 소규모 실험실8에 대해 비용이 많이 들고 저렴하지않은 고처리량 단백질 정제를 위한 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 현재 사용할 수있는 더 저렴한 판 기반 대안은 진공과 같은 접근 가능한 실험실 기반 장비의 사용을 사용합니다. 이러한 방법은 정화 속도를 개선하는 데 성공하지만, 마이크로그램 범위에서 단백질만 산출하는 작은 규모로고 처리량 정제를 달성할 수 있습니다. 이러한 제한은 미리 포장된 96개의 웰 필터 플레이트(예를 들어, 현재 Cytiva가 소유하고 있는 GE 헬스케어로부터)가 생물물리학 기술9이전에는 사용할 수 없음을 의미한다. 중력 크로마토그래피는 가장 비용 효율적인 정화 방법입니다. 그러나 여러 컬럼을 설정하는 것은 불편하며 여러 단백질에 오류가 발생하기 쉽습니다.
다중 컬럼 플레이트 어댑터(MCPA)가 성공적으로 편리하게 병렬 친화성 크로마토그래피 컬럼을 한 번에 실행하여 태그가 지정된 효모 SH3도메인(10)을정화하는 것으로 입증되었다. MCPA는 비용이 많이 드는 계측에 의존하지 않는 비용 효율적인 고처리량 정제 방법을 제공합니다. 유연한 설계는 중력 또는 진공 매니폴드 아래 여러 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통해 밀리그램의 단백질을 효과적으로 정화할 수 있습니다. 또한 수지 유형, 볼륨 및 기타 매개 변수는 각 개별 컬럼에 대해 조정하여 더 빠른 최적화를 할 수 있습니다. 이 연구는 MCPA에 의한 이온 교환 크로마토그래피를 MCPA에 의한 친화성 크로마토그래피와 함께 Abp1 SH3 도메인의 정제를 향상시키는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 추가적으로, 최대 24개의 다른 단백질은 이 방법을 사용하여 병렬로 분리될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 상대적으로 경험이 부족한 단백질 생화학자에게 사용하기쉽고 견고하지만 몇 가지 고려 사항이 있습니다.
컬렉션 플레이트 과충전에 대한 주의 사항
48웰 컬렉션 플레이트 자체는 우물당 5mL에 불과하며 각 96웰은 2mL에 불과합니다. 우물을 과도하게 채울 위험이 있기 때문에 버퍼를 추가하고 열을 통해 샘플을 실행할 때 이 점을 염?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에서 보고된 연구는 보조금 번호 P20GM103451및 리버풀 대학에서 내부 연구 교부금의 국립 의학 과학의 국립 학회에서 기관 개발 상 (IDeA)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
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