Et økonomisk og alsidigt proteinrensningssystem med høj gennemløb ved hjælp af en pladeadapter med flere kolonner
Summary
En multi-kolonne plade adapter gør det muligt kromatografi kolonner, der skal interfaces med multi-well indsamling plader til parallel affinitet eller ion udveksling rensning giver en økonomisk høj gennemløb protein rensning metode. Det kan bruges under tyngdekraften eller vakuum giver milligram mængder af protein via overkommelig instrumentering.
Abstract
Proteinrensning er afgørende for studiet af proteinstruktur og -funktion og bruges normalt i kombination med biofysiske teknikker. Det er også et centralt element i udviklingen af nye behandlingsfaktorer. Den udviklende æra af funktionelle proteomics giver næring til efterspørgslen efter højoverførselsproteinrensning og forbedrede teknikker til at lette dette. Det blev antaget, at en multi kolonne plade adapter (MCPA) kan interface flere kromatografi kolonner af forskellige harpikser med multi-well plader til parallel rensning. Denne metode tilbyder en økonomisk og alsidig metode til proteinrensning, der kan bruges under tyngdekraften eller vakuum, der konkurrerer med hastigheden på et automatiseret system. MCPA kan bruges til at genvinde milligram udbytter af protein ved en overkommelig og tidseffektiv metode til efterfølgende karakterisering og analyse. MCPA er blevet brugt til høj overførselshastigheds-affinitetsrensning af SH3-domæner. Ionudveksling er også blevet påvist via MCPA for at rense protein efter Ni-NTA-affinitetskromatografi, hvilket indikerer, hvordan dette system kan tilpasses andre rensningstyper. På grund af sin opsætning med flere kolonner kan individuel tilpasning af parametre foretages i samme rensning, der ikke kan opnås ved de nuværende pladebaserede metoder.
Introduction
Proteinrensningsteknikker til at opnå milligrammængder af rensede proteiner er afgørende for deres karakterisering og analyse, især for biofysiske metoder som NMR. Proteinrensning er også central på tværs af andre studieområder såsom lægemiddelopdagelsesprocesser og interaktionsundersøgelser af proteinprotein; men at opnå sådanne mængder rent protein kan blive en flaskehals for disse teknikker1,2,3. Den vigtigste metode til proteinrensning er kromatografi, som omfatter en række metoder, der er afhængige af proteiners individuelle egenskaber og deres tags. I affinitetskromatografi har proteiner et ekstra protein- eller peptidmotiv, der fungerer som et tag, der har en affinitet for et bestemt substrat på kromatografiharpiksen4. Den mest almindelige affinitetsmetode er immobiliseret metal affinitetskromatografi (IMAC) ved hjælp af his-mærkede proteiner, mens en anden populær metode er ionbytningskromatografi, der adskiller proteiner baseret på deres ladning. For højeste renhed, en kombination af affinitet kromatografi og ion udveksling bruges ofte sammen, som regel kræver dyrt laboratorieudstyr til høj-gennemløb.
Den udviklende æra af funktionelle proteomics giver næring til efterspørgslen efter højoverførselshastighedsteknikker til rensning af ikke enestående proteiner til specifik analyse, men et stort antal proteiner samtidig til omfattende analyse og genomdækkende undersøgelser5. Immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC) er en af de mest anvendte metoder til højoverførselsproteinrensning6,7 mendets automatiserede systemer er dyre og uoverkommelige for mindrelaboratorier 8. De mere overkommelige pladebaserede alternativer, der i øjeblikket er tilgængelige, anvender brugen af tilgængeligt laboratoriebaseret udstyr, såsom et vakuum. Selv om disse metoder har succes med at forbedre rensningshastigheden, kan det kun opnå højgennemstrømningsrensning i mindre skala, hvilket kun giver protein i mikrogramområdet. Disse begrænsninger betyder, at de færdigpakkede 96 brøndfilterplader (f.eks. fra GE Healthcare, der nu ejes af Cytiva) ikke kan anvendes før biofysiske teknikker9. Gravity kromatografi er den mest omkostningseffektive metode til rensning; Det er dog ubelejligt at oprette flere kolonner og kan være tilbøjelige til fejl for flere proteiner.
En multi kolonne plade adapter (MCPA) er blevet udviklet og vist sig at kunne med succes og bekvemt køre parallelle affinitet kromatografi kolonner på én gang for at rense His-tagged gær SH3 domæner10. MCPA tilbyder en omkostningseffektiv højgennemstrømningsrensningsmetode, der ikke afhænger af dyre instrumentering. Dens fleksible design kan effektivt rense milligram protein ved flere affinitet kromatografi kolonner under tyngdekraften eller vakuum mangfoldighed. Desuden kan harpikstype, volumen og andre parametre justeres for hver enkelt kolonne for hurtigere optimering. Denne undersøgelse viser, at MCPA’s ionudvekslingskromatografi kan bruges sammen med AFFINITY-kromatografien af MCPA til at forbedre rensningen af Abp1 SH3-domænet. Derudover kan op til 24 forskellige proteiner adskilles parallelt ved hjælp af disse metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden er robust og enkel at bruge til relativt uerfarne proteinbiokemikere, men der er et par overvejelser at huske på.
Forsigtig med overfyldning af opsamlingsplader
Selve 48-brønds kollektionspladen holder kun 5 mL pr. brønd, mens hver 96-brønd kun holder 2 mL. Dette skal holdes for øje, når du tilføjer buffer og kører prøve gennem kolonnen, da der er risiko for overfyldning af brøndene. Der skal især udvises forsigtighed ved overfør…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af en Institutional Development Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tilskud nummer P20GM103451 og en intern forskning tilskud fra University of Liverpool.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
