Et økonomisk og allsidig proteinrensesystem med høy gjennomstrømning ved hjelp av en adapter med flere kolonner
Summary
En flerkolonners plateadapter gjør det mulig å koble kromatografikolonner til flerbrønns oppsamlingsplater for parallell affinitet eller ionutvekslingsrensing, noe som gir en økonomisk proteinrensingsmetode med høy gjennomstrømning. Den kan brukes under tyngdekraften eller vakuum som gir milligram mengder protein via rimelig instrumentering.
Abstract
Proteinrensing er avgjørende for studiet av proteinstruktur og funksjon og brukes vanligvis i kombinasjon med biofysiske teknikker. Det er også en nøkkelkomponent i utviklingen av nye terapeutiske behandlinger. Den utviklende epoken med funksjonell proteomikk driver etterspørselen etter proteinrensing med høy gjennomstrømning og forbedrede teknikker for å lette dette. Det ble hypoteset at en multikolonners plateadapter (MCPA) kan grensesnitt flere kromatografikolonner av forskjellige harpikser med multi-brønnplater for parallell rensing. Denne metoden tilbyr en økonomisk og allsidig metode for proteinrensing som kan brukes under tyngdekraft eller vakuum, og konkurrerer med hastigheten til et automatisert system. MCPA kan brukes til å gjenopprette milligram proteinutbytter ved en rimelig og tidseffektiv metode for etterfølgende karakterisering og analyse. MCPA har blitt brukt til rensing av SH3-domener med høy gjennomstrømningsaffinitet. Ionutveksling har også blitt demonstrert via MCPA for å rense proteinpost Ni-NTA affinitetskromatografi, noe som indikerer hvordan dette systemet kan tilpasses andre renselsestyper. På grunn av oppsettet med flere kolonner, kan individuell tilpasning av parametere gjøres i samme rensing, uoppnåelig av de nåværende platebaserte metodene.
Introduction
Proteinrensingsteknikker for å oppnå milligram mengder rensede proteiner er avgjørende for deres karakterisering og analyse, spesielt for biofysiske metoder som NMR. Proteinrensing er også sentralt på tvers av andre studieområder som legemiddeloppdagelsesprosesser og proteinproteininteraksjonsstudier; Å oppnå slike mengder rent protein kan imidlertid bli en flaskehals for disse teknikkene1,2,3. Den viktigste metoden for proteinrensing er kromatografi, som inkluderer en rekke metoder som er avhengige av de individuelle egenskapene til proteiner og deres koder. I affinitetskromatografi har proteiner et ekstra protein- eller peptidmotiv som fungerer som en tag som har en affinitet for et bestemt substrat på kromatografiharpiksen4. Den vanligste affinitetsmetoden er immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC) ved hjelp av His-taggede proteiner, mens en annen populær metode er ionutvekslingskromatografi som skiller proteiner basert på deres ladning. For høyeste renhet brukes ofte en kombinasjon av affinitetskromatografi og ionbytte sammen, som vanligvis krever dyrt laboratorieutstyr for høy gjennomstrømning.
Den utviklende epoken med funksjonell proteomikk driver etterspørselen etter høygjennomstrømningsteknikker for rensing av ikke entall proteiner for spesifikk analyse, men et stort antall proteiner samtidig for omfattende analyse og genom brede studier5. Immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC) er en av de mest brukte metodene for proteinrensing med høy gjennomstrømning6,7, men de automatiserte systemene er kostbare og uoverkommelige for mindre laboratorier8. De rimeligere platebaserte alternativene som for tiden er tilgjengelige, bruker tilgjengelig laboratoriebasert utstyr, for eksempel et vakuum. Selv om disse metodene lykkes i å forbedre rensehastigheten, kan den bare oppnå rensing med høy gjennomstrømning i mindre skala, og gir bare protein i mikrogramområdet. Disse begrensningene betyr at de ferdigpakkede 96 brønnfilterplatene (f.eks. fra GE Healthcare som nå eies av Cytiva) ikke kan brukes før biofysiske teknikker9. Tyngdekraft kromatografi er den mest kostnadseffektive metoden for rensing; Det er imidlertid upraktisk å sette opp flere kolonner og kan være utsatt for feil for flere proteiner.
En multikolonners plateadapter (MCPA) er utviklet og bevist å kunne og enkelt kjøre parallelle affinitetskromatografikolonner samtidig for å rense His-tagged gjær SH3 domener10. MCPA tilbyr en kostnadseffektiv rensingsmetode med høy gjennomstrømning som ikke er avhengig av kostbar instrumentering. Den fleksible designen kan effektivt rense milligram protein ved hjelp av flere affinitetskromatografikolonner under tyngdekraften eller vakuummanifolden. Videre kan harpikstype, volum og andre parametere justeres for hver enkelt kolonne for raskere optimalisering. Denne studien viser at ionutvekslingskromatografi fra MCPA kan brukes sammen med affinitetskromatografi av MCPA for å forbedre rensingen av Abp1 SH3-domenet. I tillegg kan opptil 24 forskjellige proteiner skilles parallelt ved hjelp av disse metodene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden er robust og enkel å bruke for relativt uerfarne proteinbiokjemikere, men det er noen få hensyn å huske på.
Advarsel om overfylling av oppsamlingsplater
Selve oppsamlingsplaten på 48 brønner holder bare 5 ml per brønn, mens hver 96-brønn bare rommer 2 ml. Dette må tas i betraktning når du legger til buffer og kjører prøve gjennom kolonnen, da det er risiko for å overfylle brønnene. Spesielt må det tas hensyn til når du overf?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av en Institutional Development Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under tilskuddsnummer P20GM103451 og et internt forskningsstipend fra University of Liverpool.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
