Ett ekonomiskt och mångsidigt proteinreningssystem med hög genomströmning med en plattadapter med flera kolumner
Summary
En flerkolonnsplattaadapter gör det möjligt att koppla kromatografikolonner till flerbrunnsuppsamlingsplattor för parallell affinitet eller jonutbytesrening som ger en ekonomisk proteinreningsmetod med hög genomströmning. Det kan användas under gravitation eller vakuum som ger milligram mängder protein via prisvärd instrumentering.
Abstract
Proteinrening är absolut nödvändigt för studier av proteinstruktur och funktion och används vanligtvis i kombination med biofysiska tekniker. Det är också en nyckelkomponent i utvecklingen av nya terapier. Den föränderliga eran av funktionell proteomik driver efterfrågan på proteinrening med hög genomströmning och förbättrade tekniker för att underlätta detta. det var hypotetiskt att en multi-column plate adapter (MCPA) kan gränssnitt flera kromatografi kolumner av olika hartser med multi-well plattor för parallell rening. Denna metod erbjuder en ekonomisk och mångsidig metod för proteinrening som kan användas under gravitation eller vakuum, som konkurrerar med hastigheten hos ett automatiserat system. MCPA kan användas för att återställa milligram utbyten av protein med en prisvärd och tidseffektiv metod för efterföljande karakterisering och analys. MCPA har använts för hög genomströmnings affinitets rening av SH3 domäner. Jonutbyte har också demonstrerats via MCPA för att rena proteinet efter Ni-NTA affinitetskromatografi, vilket indikerar hur detta system kan anpassas till andra reningstyper. På grund av installationen med flera kolumner kan individuell anpassning av parametrar göras i samma rening, som inte kan uppnås med de aktuella plåtbaserade metoderna.
Introduction
Protein rening tekniker för att uppnå milligram mängder renade proteiner är absolut nödvändigt för deras karakterisering och analys, särskilt för biofysiska metoder såsom NMR. Proteinrening är också centralt inom andra studieområden såsom läkemedelsupptäcktsprocesser och proteinproteininteraktionsstudier; Att uppnå sådana mängder rent protein kan dock bli en flaskhals för dessa tekniker1,2,3. Den huvudsakliga metoden för proteinrening är kromatografi, som innehåller en mängd olika metoder som förlitar sig på de enskilda egenskaperna hos proteiner och deras taggar. Vid affinitetskromatografi har proteiner ett extra protein- eller peptidmotiv som fungerar som en tagg som har en affinitet för ett visst substrat på kromatografihartset4. Den vanligaste affinitetsmetoden är immobiliserad metall affinitetskromatografi (IMAC) med hjälp av his-taggade proteiner, medan en annan populär metod är jonutbyte kromatografi som separerar proteiner baserat på deras laddning. För högsta renhet används ofta en kombination av affinitetskromatografi och jonutbyte tillsammans, vilket vanligtvis kräver dyr labbutrustning för hög genomströmning.
Den föränderliga eran av funktionell proteomik driver efterfrågan på hög genomströmningstekniker för rening av inte ovanliga proteiner för specifik analys utan ett stort antal proteiner samtidigt för omfattande analys och genom breda studier5. Immobiliserad metall affinitetskromatografi (IMAC) är en av de mest använda metoderna för hög genomströmning protein rening6,7 men dess automatiserade system är kostsamma och oöverkomliga för mindre laboratorier8. De mer prisvärda plåtbaserade alternativ som för närvarande finns tillgängliga använder tillgänglig laboratoriebaserad utrustning, till exempel ett vakuum. Även om dessa metoder är framgångsrika för att förbättra reningshastigheten, kan det bara uppnå hög genomströmningsrening i mindre skala, vilket bara ger protein i mikrogramområdet. Dessa begränsningar innebär att de färdigförpackade 96 brunnsfilterplattorna (t.ex. från GE Healthcare som nu ägs av Cytiva) inte kan användas före biofysiska tekniker9. Gravitationkromatografi är den mest kostnadseffektiva reningsmetoden; Att ställa in flera kolumner är dock obekvämt och kan vara benägen att fel för flera proteiner.
En multikolonn plattadapter (MCPA) har utvecklats och visat sig framgångsrikt och bekvämt köra parallell affinitet kromatografi kolumner på en gång för att rena His-tagged jäst SH3 domäner10. MCPA erbjuder en kostnadseffektiv reningsmetod med hög genomströmning som inte är beroende av dyr instrumentering. Dess flexibla design kan effektivt rena milligram protein genom flera affinitetskromatografikolonner under gravitation eller vakuumgrenrör. Dessutom kan hartstyp, volym och andra parametrar justeras för varje enskild kolumn för snabbare optimering. Denna studie visar att jon utbyte kromatografi av MCPA kan användas tillsammans med affinitet kromatografi av MCPA för att förbättra reningen av Abp1 SH3 domänen. Dessutom kan upp till 24 olika proteiner separeras parallellt med dessa metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden är robust och enkel att använda för relativt oerfarna proteinbiokemister, men det finns några överväganden att tänka på.
Varning för överfyllning av uppsamlingsplattor
Själva uppsamlingsplattan på 48 brunnar rymmer bara 5 ml per brunn medan varje 96-brunn endast rymmer 2 ml. Detta måste hållas i åtanke när du lägger till buffert och kör prov genom kolumnen eftersom det finns risk för överfyllning av brunnarna. I synnerhet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av en Institutional Development Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer P20GM103451 och ett internt forskningsanslag från University of Liverpool.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
