Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter

Zusammenfassung

Ein Mehrsäulenplattenadapter ermöglicht die Schnittstelle von Chromatographiesäulen mit Multi-Well-Sammelplatten für die parallele Affinitäts- oder Ionenaustauschreinigung, was eine wirtschaftliche Proteinreinigungsmethode mit hohem Durchsatz bietet. Es kann unter Schwerkraft oder Vakuum verwendet werden, wodurch Milligrammmengen an Protein über erschwingliche Instrumente erhalten werden.

Zusammenfassung

Die Proteinreinigung ist für die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion unerlässlich und wird normalerweise in Kombination mit biophysikalischen Techniken verwendet. Es ist auch eine Schlüsselkomponente bei der Entwicklung neuer Therapeutika. Die sich entwickelnde Ära der funktionellen Proteomik befeuert die Nachfrage nach Hochdurchsatz-Proteinreinigung und verbesserten Techniken, um dies zu erleichtern. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Mehrsäulenplattenadapter (MCPA) mehrere Chromatographiesäulen verschiedener Harze mit Multi-Well-Platten zur parallelen Reinigung verbinden kann. Diese Methode bietet eine wirtschaftliche und vielseitige Methode der Proteinreinigung, die unter Schwerkraft oder Vakuum eingesetzt werden kann und mit der Geschwindigkeit eines automatisierten Systems mithalten kann. Das MCPA kann verwendet werden, um Milligramm-Ausbeute an Protein durch eine erschwingliche und zeiteffiziente Methode für die nachfolgende Charakterisierung und Analyse wiederherzustellen. Der MCPA wurde für die Hochdurchsatz-Affinitätsreinigung von SH3-Domänen verwendet. Der Ionenaustausch wurde auch über das MCPA demonstriert, um Proteine nach der Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu reinigen, was darauf hinweist, wie dieses System an andere Reinigungstypen angepasst werden kann. Aufgrund des Aufbaus mit mehreren Spalten kann die individuelle Anpassung der Parameter in der gleichen Reinigung vorgenommen werden, was mit den aktuellen plattenbasierten Methoden nicht erreichbar ist.

Einleitung

Proteinreinigungstechniken, um Milligrammmengen an gereinigten Proteinen zu erreichen, sind für ihre Charakterisierung und Analyse unerlässlich, insbesondere für biophysikalische Methoden wie NMR. Die Proteinreinigung ist auch in anderen Studienbereichen wie Arzneimittelentdeckungsprozessen und Protein-Protein-Interaktionsstudien von zentraler Bedeutung. Das Erreichen solcher Mengen an reinem Protein kann jedoch zu^einemEngpass für diese Techniken werden 1^,2,3. Die Hauptmethode zur Proteinreinigung ist die Chromatographie, die eine Vielzahl von Methoden umfasst, die auf den in....

Protokoll

1. Denaturierung der Ni-NTA-Chromatographie

1. Vorbereiten von Puffern
   HINWEIS: Einzelheiten zu allen Puffern finden Sie in Tabelle 1.
   1. Machen Sie 500 ml 0,5 M NaOH, achten Sie darauf, zuerst das Milli-Q-Wasser hinzuzufügen und dann das NaOH langsam hinzuzufügen, während sich das Becherglas auf einem Rührer befindet. Filtern Sie mit einem 0,22 μm Filter.
   2. 100 ml 0,1 M Nickelsulfat vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtern.
   3. 50 ml 2 M Imidazol vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtern.
   4. 1,5 l Denaturierungspuffer bei pH 8,0, bestehend aus 5,3 mM Tris-HCl, 4,7 mM Tris-Base (Tr....

Ergebnisse

So hat das MCPA beispielsweise 14 AbpSH3-Mutanten unter Denaturierungsbedingungen erfolgreich über Ni-NTA gereinigt (Abbildung 2A). Eine kleine Verunreinigung ~ 25 kDa ist zu sehen, jedoch ist das Protein immer noch weitgehend rein. Es wird angenommen, dass es sich bei dieser Verunreinigung um YodA handelt, ein häufiges co-gereinigtes Protein, das in E. coli¹¹gefundenwird. Abbildung 2B zeigt die Reinigung von 11 verschie.......

Diskussion

Die Methode ist robust und für relativ unerfahrene Proteinbiochemiker einfach zu bedienen, es gibt jedoch einige Überlegungen zu beachten.

Vorsicht bei Überfüllung von Sammelplatten

Die 48-Well-Auffangplatte selbst fasst nur 5 ml pro Vertiefung, während jede 96-Well nur 2 ml fasst. Dies muss beim Hinzufügen von Puffer und beim Durchlaufen der Probe durch die Säule berücksichtigt werden, da die Gefahr einer Überfüllung der Vertiefungen besteht. Insbe.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2 mL/ Well-Entnahmeplatte	Agilent technologies	201240-100
5 mL/ Well-Entnahmeplatte	Agilent technologies	201238-100
12 mL Chromatographiesäulen	Bio-Rad	7311550
96 Well, lange Tropfplatte	Agilent technologies	200919-100	Werden mit 0,25 μm-Filtern geliefert, die entfernt werden müssen.
96 Well Plattendichtung/Matte	Agilent Technologies	201158-100	Sollte peirceable
sein His60 Ni Superflow Resin	Takara Bio	635660
HiTrap Q HP Anionenaustauschsäule	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lvis Plattenleser	BMG LABTECH		Kompatibel mit FLUOstar Omega Plattenleser
Männliche Leurplugs	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep 96 Well Vakuum Verteiler Starter Kit	Sigma-Aldrich	575650-U
Reservoir Auffangplatte	Agilent technologies	201244-100
Der Repeater Plus	Eppendorf	2226020	Mit 5 mL und 50 mL Spritzen
VACUSAFE vacuum	INTEGRA	158 320	Der vacusafe vacuum verfügt über einen Vakuumbereich von 300 mBar bis 600 mBar und eine 4 l Abfallauffangflasche