Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter
Summary
Ein Mehrsäulenplattenadapter ermöglicht die Schnittstelle von Chromatographiesäulen mit Multi-Well-Sammelplatten für die parallele Affinitäts- oder Ionenaustauschreinigung, was eine wirtschaftliche Proteinreinigungsmethode mit hohem Durchsatz bietet. Es kann unter Schwerkraft oder Vakuum verwendet werden, wodurch Milligrammmengen an Protein über erschwingliche Instrumente erhalten werden.
Abstract
Die Proteinreinigung ist für die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion unerlässlich und wird normalerweise in Kombination mit biophysikalischen Techniken verwendet. Es ist auch eine Schlüsselkomponente bei der Entwicklung neuer Therapeutika. Die sich entwickelnde Ära der funktionellen Proteomik befeuert die Nachfrage nach Hochdurchsatz-Proteinreinigung und verbesserten Techniken, um dies zu erleichtern. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Mehrsäulenplattenadapter (MCPA) mehrere Chromatographiesäulen verschiedener Harze mit Multi-Well-Platten zur parallelen Reinigung verbinden kann. Diese Methode bietet eine wirtschaftliche und vielseitige Methode der Proteinreinigung, die unter Schwerkraft oder Vakuum eingesetzt werden kann und mit der Geschwindigkeit eines automatisierten Systems mithalten kann. Das MCPA kann verwendet werden, um Milligramm-Ausbeute an Protein durch eine erschwingliche und zeiteffiziente Methode für die nachfolgende Charakterisierung und Analyse wiederherzustellen. Der MCPA wurde für die Hochdurchsatz-Affinitätsreinigung von SH3-Domänen verwendet. Der Ionenaustausch wurde auch über das MCPA demonstriert, um Proteine nach der Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu reinigen, was darauf hinweist, wie dieses System an andere Reinigungstypen angepasst werden kann. Aufgrund des Aufbaus mit mehreren Spalten kann die individuelle Anpassung der Parameter in der gleichen Reinigung vorgenommen werden, was mit den aktuellen plattenbasierten Methoden nicht erreichbar ist.
Introduction
Proteinreinigungstechniken, um Milligrammmengen an gereinigten Proteinen zu erreichen, sind für ihre Charakterisierung und Analyse unerlässlich, insbesondere für biophysikalische Methoden wie NMR. Die Proteinreinigung ist auch in anderen Studienbereichen wie Arzneimittelentdeckungsprozessen und Protein-Protein-Interaktionsstudien von zentraler Bedeutung. Das Erreichen solcher Mengen an reinem Protein kann jedoch zueinemEngpass für diese Techniken werden 1,2,3. Die Hauptmethode zur Proteinreinigung ist die Chromatographie, die eine Vielzahl von Methoden umfasst, die auf den individuellen Eigenschaften von Proteinen und ihren Tags basieren. In der Affinitätschromatographie haben Proteine ein zusätzliches Protein- oder Peptidmotiv, das als Tag fungiert, das eine Affinität für ein bestimmtes Substrat auf dem Chromatographieharz4 aufsät. Die gebräuchlichste Affinitätsmethode ist die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mit His-markierten Proteinen, während eine andere beliebte Methode die Ionenaustauschchromatographie ist, die Proteine basierend auf ihrer Ladung trennt. Für höchste Reinheit wird häufig eine Kombination aus Affinitätschromatographie und Ionenaustausch zusammen verwendet, was in der Regel teure Laborgeräte für einen hohen Durchsatz erfordert.
Die sich entwickelnde Ära der funktionellen Proteomik befeuert die Nachfrage nach Hochdurchsatztechniken, um nicht einzelne Proteine für spezifische Analysen, sondern eine große Anzahl von Proteinen gleichzeitig für umfassende Analysen und genomweite Studien zu reinigen5. Die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) ist eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Hochdurchsatzproteinreinigung6,7, aber ihre automatisierten Systeme sind teuer und für kleinere Labore unerschwinglich8. Die erschwinglicheren plattenbasierten Alternativen, die derzeit verfügbar sind, verwenden zugängliche Laborgeräte wie ein Vakuum. Obwohl diese Methoden die Reinigungsgeschwindigkeit erfolgreich verbessern, kann sie nur in kleinerem Maßstab eine Hochdurchsatzreinigung erreichen und nur Protein im Mikrogrammbereich liefern. Diese Einschränkungen bedeuten, dass die vorverpackten 96-Well-Filterplatten (z. B. von GE Healthcare, die jetzt im Besitz von Cytiva sind) nicht vor biophysikalischen Techniken verwendet werden können9. Die Schwerkraftchromatographie ist die kostengünstigste Reinigungsmethode. Das Einrichten mehrerer Spalten ist jedoch umständlich und kann für mehrere Proteine fehleranfällig sein.
Ein Mehrsäulenplattenadapter (MCPA) wurde entwickelt und bewährt, um parallele Affinitätschromatographiesäulen gleichzeitig erfolgreich und bequem auszuführen, um his-markierte Hefe-SH3-Domänen zu reinigen10. Der MCPA bietet eine kosteneffiziente Hochdurchsatz-Reinigungsmethode, die nicht auf kostspielige Instrumentierung angewiesen ist. Sein flexibles Design kann Milligramm Protein durch mehrere Affinitätschromatographiesäulen unter Schwerkraft oder Vakuumverteiler effektiv reinigen. Darüber hinaus können Harztyp, Volumen und andere Parameter für jede einzelne Säule angepasst werden, um eine schnellere Optimierung zu erreichen. Diese Studie zeigt, dass die Ionenaustauschchromatographie durch das MCPA in Verbindung mit der Affinitätschromatographie durch das MCPA verwendet werden kann, um die Aufreinigung der Abp1 SH3-Domäne zu verbessern. Zusätzlich können mit diesen Methoden bis zu 24 verschiedene Proteine parallel getrennt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methode ist robust und für relativ unerfahrene Proteinbiochemiker einfach zu bedienen, es gibt jedoch einige Überlegungen zu beachten.
Vorsicht bei Überfüllung von Sammelplatten
Die 48-Well-Auffangplatte selbst fasst nur 5 ml pro Vertiefung, während jede 96-Well nur 2 ml fasst. Dies muss beim Hinzufügen von Puffer und beim Durchlaufen der Probe durch die Säule berücksichtigt werden, da die Gefahr einer Überfüllung der Vertiefungen best…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde durch einen Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM103451 und einen internen Forschungsstipendium der University of Liverpool unterstützt.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
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