JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Cancer Research

Patient-afledt tumor explants som en "Live" præklinisk platform til forudsigelse af resistens hos patienter

Published: February 07, 2021
doi:
10.3791/62130
, , , , , , , , , , ,
1Leicester Cancer Research Center,University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit

Summary

Dette papir beskriver metoder til generering, lægemiddelbehandling og analyse af patientafledte explants til vurdering af tumormedicinresponser i et levende, patientrelevant, præklinisk modelsystem.

Abstract

En forståelse af resistens over for lægemidler og udvikling af nye strategier til at sensibilisere meget resistente kræftformer er afhængige af tilgængeligheden af egnede prækliniske modeller, der præcist kan forudsige patientens reaktioner. En af ulemperne ved eksisterende prækliniske modeller er den manglende evne til kontekstuelt at bevare det menneskelige tumormikromiljø (TME) og nøjagtigt repræsentere intratumoral heterogenitet, hvilket begrænser den kliniske oversættelse af data. I modsætning hertil, ved at repræsentere kulturen af levende fragmenter af menneskelige tumorer, den patient-afledte explant (PDE) platform tillader narkotika svar, der skal undersøges i en tre-dimensionel (3D) sammenhæng, der afspejler de patologiske og arkitektoniske træk ved de oprindelige tumorer så tæt som muligt. Tidligere rapporter med PDEs har dokumenteret platformens evne til at skelne kemosensitive fra chemoresistant tumorer, og det har vist sig, at denne adskillelse er forudsigende for patientens reaktioner på de samme kemoterapier. Samtidig giver PDEs mulighed for at afhøre molekylære, genetiske og histologiske træk ved tumorer, der forudsiger lægemiddelresponser og derved identificerer biomarkører til patient stratificering samt nye interventionelle tilgange til at sensibilisere resistente tumorer. Dette papir rapporterer PDE-metoden i detaljer, fra indsamling af patientprøver til endpoint-analyse. Det giver en detaljeret beskrivelse af explant afledning og kultur metoder, der fremhæver skræddersyede betingelser for bestemte tumorer, hvor det er relevant. Til endpointanalyse er der fokus på multiplexed immunofluorescence og multispektral billeddannelse til rumlig profilering af nøglebiomarkører inden for både tumorale og stromale regioner. Ved at kombinere disse metoder er det muligt at generere kvantitative og kvalitative lægemiddelresponsdata, der kan relateres til forskellige klinikopatologiske parametre og dermed potentielt bruges til biomarkøridentifikation.

Introduction

Udviklingen af effektive og sikre kræftmidler kræver passende prækliniske modeller, der også kan give indsigt i virkningsmekanismer, der kan lette identifikationen af prædiktive og farmakodynamiske biomarkører. Inter- og intratumor heterogenitet1,2,3,4,5 og TME6,7,8,9,10,11,12 er kendt for at påvirke anticancer narkotika svar, og mange eksisterende prækliniske kræft modeller såsom cellelinjer, organoider, og musemodeller er ikke i stand til fuldt ud at rumme disse afgørende Funktioner. En “ideel” model er en, der kan generobre de komplekse rumlige interaktioner af maligne med ikke-ondartede celler i tumorer samt afspejle de regionale forskelle inden for tumorer. Denne artikel fokuserer på PDF-filer som en ny platform, der kan opfylde mange af disse krav13.

Det første eksempel på brugen af menneskelige PDEs, også kendt som histokulturer, går tilbage til slutningen af 1980’erne, da Hoffman et al. genererede skiver af nyopførte menneskelige tumorer og dyrkede dem i en kollagenmatrix14,15. Dette indebar etablering af et 3D-kultursystem, der bevarede vævsarkitektur, hvilket sikrede vedligeholdelse af stromale komponenter og celleinteraktioner inden for TME. Uden at dekonstruere den oprindelige tumor, Hoffman et al.16 varslede en ny tilgang til translationel forskning, og siden denne tid, mange grupper har optimeret forskellige explant metoder med det formål at bevare væv integritet og generere nøjagtige lægemiddelrespon data17,18,19,20,21,22,23,24 , selv om nogle forskelle mellem protokollerne er tydelige. Butler et al. dyrkede explants i gelatine svampe til at hjælpe udbredelsen af næringsstoffer og narkotika gennem prøven20,21,25, mens Majumder et al. skabt en tumor økosystem ved dyrkning explants på toppen af en matrix bestående af tumor og stromale proteiner i overværelse af autolog serum stammer fra samme patient22, 23.

For nylig oprettede vores gruppe en protokol, hvorved explants genereres ved fragmentering af tumorer i 2 – 3 mm3-størrelsestykker, der derefter placeres uden yderligere komponenter på gennemtrængelige membraner ved luft-flydende interface af et kultursystem24. Tilsammen har disse talrige undersøgelser vist, at PDEs tillader kulturen af intakte, levende fragmenter af menneskelige tumorer, der bevarer den rumlige arkitektur og regionale heterogenitet af de oprindelige tumorer. I originale forsøg blev explants eller histokulturer normalt udsat for homogenisering efter lægemiddelbehandling, hvorefter der blev anvendt forskellige levedygtighedsanalyser på de homogeniserede prøver såsom histokulturlægemiddelrespons assay20,21, MTT (3-(6)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) assay, laktat dehydrogenase assay, eller resazurin-baserede assay26,27,28 . Nylige fremskridt inden for endpointanalyseteknikker, især digital patologi, har nu udvidet repertoiret af endpointtests og -analyser, der kan udføres på explants29,30. For at anvende disse nye teknologier, i stedet for homogenisering, explants er fastsat i formalin, indlejret i paraffin (FFPE) og derefter analyseret ved hjælp af immunstaining teknikker, der tillader rumlig profilering. Eksempler på denne fremgangsmåde er blevet dokumenteret for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), brystkræft, kolorektal cancer, og lungehindekræft explants hvorved immunohistokemisk farvning for spredning markør, Ki67, og apoptotisk markør, kløvet poly-ADP ribose polymerase (cPARP), blev brugt til at overvåge ændringer i cellespredning og celledød24,31,32,33,34.

Multipelxet immunofluorescence er særligt modtagelig for rumlig profilering af lægemiddelresponser i explants ved slutpunkt35. For eksempel er det muligt at måle omfordeling og rumlig fordeling af specifikke klasser af immunceller, såsom makrofager eller T-celler, inden for TME ved lægemiddelbehandling13,36,37,38, og undersøge, om et terapeutisk middel kan favorisere overgangen fra “kold tumor” til “hot tumor”39 . I de senere år har denne gruppe fokuseret på afledning af PDEs fra forskellige tumortyper (NSCLC, nyrekræft, brystkræft, kolorektal cancer, melanom) og testning af en række anticancermidler, herunder kemoterapier, småmolekylehæmmere og immunkontrolpunkthæmmere (ICIs). Endpoint analysemetoder er blevet optimeret til at omfatte multiplexed immunofluorescence at tillade rumlig profilering af biomarkører for levedygtighed samt biomarkører for forskellige bestanddele af TME.

Protocol

1. Vævssamling Efter operationen overføres nyopførte menneskelige tumorprøver til et rør, der indeholder 25 mL frisk kulturmedium (Dulbeccos modificerede Eagle medium suppleret med 4,5 g/L glukose og L-glutamin + 1% (v/v) fosterkalkale serum + 1% penicillin-streptomycin) og opbevares på is. Behandle explant inden for 2 timer af kirurgi i en steril klasse II hætte. 2. Explant forberedelse Rengør alt kirurgisk u…

Representative Results

Multispektral billeddannelse af mIF-farvede histologiske sektioner gør det muligt at identificere og fænotypiske individuelle cellepopulationer og identifikation af tumor- og stromalkomponenter i explant TME (figur 2). Multispektral billeddannelse er især nyttig til analyse af væv med høj iboende autofluorescence, såsom væv med et højt kollagenindhold, da det gør det muligt for autofluorescencesignalet at blive devoluteret fra andre signaler og udelukket fra efterfølgende analyse. …

Discussion

Dette papir beskriver metoderne til generering, lægemiddelbehandling og analyse af PDEs og fremhæver fordelene ved platformen som et præklinisk modelsystem. Ex vivo dyrkning af en frisk resected tumor, som ikke indebærer dens dekonstruktion, giver mulighed for fastholdelse af tumor arkitektur13,24 og dermed de rumlige interaktioner af cellulære komponenter i TME samt intratumoral heterogenitet. Denne metode viser, hvordan det ved hjælp af en tumorspecifik m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker kirurger og patologer på University Hospitals of Leicester NHS Trust for at give kirurgisk resected tumorvæv. Vi takker også Histology facilitet inden for Core Biotechnology Services for hjælp med vævsbehandling og ræsning af FFPE væv blokke og Kees Straatman for støtte med brug af Vectra Polaris. Denne forskning blev støttet og finansieret af Explant Consortium bestående af fire partnere: University of Leicester, MRC Toxicology Unit, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories og LifeArc. Der blev ydet yderligere støtte fra CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Finansiering af GM, CD og NA blev ydet af Breast Cancer Now’s Catalyst Programme (2017NOVPCC1066), som støttes af midler fra Pfizer.

Materials

Acetic acid Sigma 320099 Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1x Perkin Elmer ARD1001EA Antibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure Diamond Barnstead Ultra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid Monohydrate Sigma-Aldrich C7129 Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture Plates Corning Incorporated 3516 6 multiwell plate
DAPI Dilactate Life Technologies D3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 150350 100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate Gibco (Life Technologies) 10569-010 Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountant VWR 360294H Mounting medium
DPX mountant Merck 6522 Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 3609 Reagent for TE buffer
Eosin CellPath RBC-0100-00A Staining reagent
Foetal Bovine Serum Gibco 10500-064 For use in tissue culture medium
37% Formaldehyde Fisher (Acros) 119690010 10% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095 iGenix IG2095 Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS) Genta Medical 199050 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis Software Akoya Biosciences InForm
Leica ASP3000 Tissue Processor Leica Biosystems Automated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and C Leica Biosystems Embedding wax bath
Leica RM2125RT Leica Biosystems Rotary microtome
Leica ST4040 Linear Stainer Leica Biosystems H&E stainer
Mayer's Haematoxylin Sigma GHS132-1L Staining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm Merck Milipore PICMORG50 Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection System Leica Biosystems RE7150-K DAB staining kit
OPAL 480 Akoya Biosciences FP1500001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520 Akoya Biosciences FP1487001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570 Akoya Biosciences FP1488001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620 Akoya Biosciences FP1495001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650 Akoya Biosciences FP1496001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690 Akoya Biosciences FP1497001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent Akoya Biosciences FP1501001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x Perkin Elmer ARH1001EA HRP polymer
Penicillin/streptomycin solution Fisher Scientific 11548876 For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer Akoya Biosciences PhenoChart Viewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline Tablets Thermo Scientific Oxoid BR0014G PBS
1x Plus Amplification Diluent Perkin Elmer FP1498 Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36961 Mounting medium
Slide Carrier Perkin Elmer To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium Chloride Fisher Scientific S/3160/63 10% Formalin
Sodium Hydroxide pellets Fisher Scientific S/4920/53 Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) KEMDENT 1-601 Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center Fisher Scientific 10098889 Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates Fisher Scientific 11927774 Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich 252859 Reagent for TE buffer
VectaShield Vecta Laboratories H-1000-10 Mounting medium
Vectra Polaris Slide Scanner Perkin Elmer Vectra Polaris Slide scanner
Xylene Genta Medical XYL050 De-waxing agent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
  2. Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
  3. McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  4. Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
  5. Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
  6. Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
  7. Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
  8. Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
  9. Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, 9-17 (2009).
  10. Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
  11. Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
  12. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
  13. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  14. Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
  15. Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
  16. Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
  17. Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
  18. Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
  21. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
  22. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
  23. Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
  24. Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
  25. Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
  26. Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
  27. Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
  28. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
  29. Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
  30. Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
  31. Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
  32. Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
  33. Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
  34. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
  35. Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
  36. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  37. Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
  38. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  39. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
  40. Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
  41. Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
  42. Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
  43. Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
  44. Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
  45. Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 3631 (2016).
  46. Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 815 (2017).
  47. Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
  48. Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).

Tags

Patient-derived Tumor ExplantsPreclinical PlatformDrug Resistance Prediction3D Tumor ContextDrug ResponseDrug MetabolismPharmacodynamic BiomarkersOrganotypic CultureDrug TreatmentFormalin FixationHistological Processing
check_url/62130?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Viticchié, G., Powley, I., Demetriou, C., Cooper, J., Butterworth, M., Patel, M., Abid, N., Miles, G., Howells, L., Pringle, H., MacFarlane, M., Pritchard, C. Patient-Derived Tumor Explants As a “Live” Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients. J. Vis. Exp. (168), e62130, doi:10.3791/62130 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image