גידול שמקורו במטופל explants כפלטפורמה פרה-אקלינית "חיה" לחיזוי עמידות לתרופות בחולים
Summary
מאמר זה מתאר שיטות לדור, טיפול תרופתי וניתוח של explants נגזרים על ידי המטופל להערכת תגובות לתרופות גידול במערכת מודל חי, רלוונטי למטופל, פרה-קלינית.
Abstract
הבנה של עמידות לתרופות ופיתוח אסטרטגיות חדשניות לחש סרטן עמיד מאוד מסתמכים על זמינותם של מודלים פרה-אקליניים מתאימים שיכולים לחזות במדויק את תגובות המטופלים. אחד החסרונות של מודלים פרה-קליניים קיימים הוא חוסר היכולת לשמר בהקשר את מיקרו-וירוס הגידול האנושי (TME) ולייצג במדויק הטרוגניות תוך-אנושית, ובכך להגביל את התרגום הקליני של נתונים. לעומת זאת, על ידי ייצוג התרבות של שברים חיים של גידולים אנושיים, פלטפורמת explant נגזרת המטופל (PDE) מאפשרת לבחון תגובות סמים בהקשר תלת מימדי (3D) המשקף את התכונות הפתולוגיות והארכיטקטוניות של הגידולים המקוריים מקרוב ככל האפשר. דיווחים קודמים עם PDEs תיעדו את היכולת של הפלטפורמה להבחין בין כימוס רגישים לבין גידולים עמידים chemore, והוכח כי הפרדה זו מנבאת את תגובות המטופל לאותן כימותרפיות. במקביל, PDEs מאפשרים את ההזדמנות לחקור תכונות מולקולריות, גנטיות והיסתולוגיות של גידולים המנבאים תגובות לתרופות, ובכך לזהות סמנים ביולוגיים עבור ריבוד מטופלים, כמו גם גישות התערבותיות חדשניות לחש גידולים עמידים. מאמר זה מדווח על מתודולוגיית PDE בפירוט, מאיסוף דגימות מטופלים ועד לניתוח נקודות קצה. הוא מספק תיאור מפורט של שיטות נגזרות ותרבות, המדגיש תנאים מותאמים לגידולים מסוימים, במידת הצורך. לניתוח נקודות קצה, יש דגש על אימונופלואורסצנטיות מרובת מולטיפלקסים והדמיה רב-ספקטרלית ליצירת פרופיל מרחבי של סמנים ביולוגיים מרכזיים בתוך אזורים גידוליים ושטרומליים כאחד. על ידי שילוב שיטות אלה, ניתן לייצר נתוני תגובה כמותית ואיכותית לתרופות שיכולים להיות קשורים לפרמטרים קליניאופתולוגיים שונים ובכך עשויים לשמש לזיהוי סמן ביולוגי.
Introduction
הפיתוח של סוכני נגד נגדים יעילים ובטוחים דורש מודלים פרה-אקליניים מתאימים שיכולים גם לספק תובנה על מנגנוני פעולה שיכולים להקל על זיהוי של סמנים ביולוגיים חזויים ופרמקודינמיים. בין-1,2,3,4,5 ו- TME6,7,8,9,10,11,12 ידועים כמשפיעים על תגובות תרופות נגד סרטן, ומודלים קיימים רבים של סרטן פרה-אקליני כגון קווי תאים, אורגנוידים ומודלים של עכבר אינם מסוגלים להכיל באופן מלא את אלה חיוניים תכונות. מודל “אידיאלי” הוא מודל שיכול לשחזר את האינטראקציות המרחביות המורכבות של ממאיר עם תאים לא ממאירים בתוך גידולים, כמו גם לשקף את ההבדלים האזוריים בתוך גידולים. מאמר זה מתמקד PDEs כפלטפורמה מתפתחת שיכולה למלא רבים מדרישות אלה13.
הדוגמה הראשונה לשימוש ב- PDEs אנושי, הידוע גם בשם היסטוקולטורות, מתוארכת לסוף שנות השמונים כאשר הופמן ואח ‘יצרו פרוסות של גידולים אנושיים שנכרתו טריים ותרבלו אותם במטריצה קולגן14,15. זה היה כרוך בהקמת מערכת תרבית תלת-ממדית ששימרה את ארכיטקטורת הרקמות, והבטיחה שמירה על רכיבים סטרומיים ואינטראקציות תאים בתוך ה- TME. מבלי לפרק את הגידול המקורי, הופמן ואח ‘16 מבשרים על גישה חדשה של מחקר תרגום, ומאז, קבוצות רבות מיטבו שיטות הסבר שונות במטרה לשמור על שלמות הרקמה ולייצר נתוני תגובה מדויקים לתרופות17,18,19,20,21,22,23,24 למרות כמה הבדלים בין פרוטוקולים ניכרים., באטלר ואח ‘ explants תרבותית ספוגי ג’לטין כדי לעזור דיפוזיה של חומרים מזינים ותרופות באמצעות הדגימה20,21,25, ואילו מג’ומדר ואח ‘יצר מערכת אקולוגית גידול על ידי culturing explants על גבי מטריצה המורכבת של גידול וחלבונים סטרומיים בנוכחות סרום אוטולוגי נגזר מאותו חולה22, 23.
לאחרונה, הקבוצה שלנו הקימה פרוטוקול לפיו explants נוצרים על ידי פיצול של גידולים לתוך 2 – 3 מ”מ3– חתיכות בגודל כי הם ממוקמים לאחר מכן ללא רכיבים נוספים על ממברנות חדירים בממשק אוויר נוזלי של מערכת תרבות24. יחד, מחקרים רבים אלה הוכיחו כי PDEs מאפשרים את התרבות של שלם, שברים חיים של גידולים אנושיים השומרים על הארכיטקטורה המרחבית וההטרוגניות האזורית של הגידולים המקוריים. בניסויים מקוריים, explants או histocultures היו בדרך כלל נתון הומוגניזציה בעקבות טיפול תרופתי, ולאחר מכן בדיקות קיימא שונות הוחלו על דגימות הומוגניות כגון אסאי תגובת התרופה היסטוקולטורה20,21, MTT (3-(6)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד) אסי, ההסתה של הלקטט דהידרוגנאז, או אסאי מבוסס רסזורין26,27,28 . ההתקדמות האחרונה בטכניקות ניתוח נקודות קצה, במיוחד פתולוגיה דיגיטלית, הרחיבו כעת את הרפרטואר של בדיקות נקודת קצה ובדיקות שניתן לבצע על explants29,30. כדי ליישם טכנולוגיות חדשות אלה, במקום הומוגניזציה, explants קבועים פורמלין, מוטבע פרפין (FFPE) ולאחר מכן מנותח באמצעות טכניקות חיסוניות, המאפשר פרופיל מרחבי. דוגמאות לגישה זו תועדו עבור סרטן ריאות תאים לא קטנים (NSCLC), סרטן השד, סרטן המעי הגס, ו explants mesothelioma לפיה כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור סמן ההתפשטות, Ki67, ואת הסמן אפופטוטי, פולי-ADP פולימראז (cPARP), שימש לניטור שינויים התפשטות התא ומוות תאים24,31,32,33,34.
אימונופלואורסצנטיות מרובת קסים נוחה במיוחד ליצירת פרופיל מרחבי של תגובות סמים ב explants בנקודת קצה35. לדוגמה, ניתן למדוד את ההקצאה מחדש ואת ההתפלגות המרחבית של סוגים ספציפיים של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים או תאי T, בתוך TME על טיפול תרופתי13,36,37,38, ולחקור אם סוכן טיפולי יכול להעדיף את המעבר מ”גידול קר “ל”גידול חם“39 . בשנים האחרונות, קבוצה זו התמקדה בהפקת PDEs מסוגי גידולים שונים (NSCLC, סרטן כליות, סרטן השד, סרטן המעי הגס, מלנומה) ובדיקה של מגוון של חומרים נגד סרטן כולל כימותרפיה, מעכבי מולקולות קטנות, ומעכבי מחסום חיסוני (ICIs). שיטות ניתוח נקודות קצה עברו אופטימיזציה כדי לכלול אימונופלואורסצנטיות מרובת-קסים כדי לאפשר יצירת פרופיל מרחבי של סמנים ביולוגיים לצורך כדאיות, כמו גם סמנים ביולוגיים עבור מרכיבים שונים של TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר את שיטות הדור, הטיפול התרותי והניתוח של מחשבי כף יד ומדגיש את היתרונות של הפלטפורמה כמערכת מודל פרה-קלינית. פולחן Ex vivo של גידול שנפלט טרי, שאינו כרוך בפירוקו, מאפשר שימור של ארכיטקטורת הגידול13,24 ולכן, את האינטראקציות המרחביות של רכיבים תאיים ב- TME…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למנתחים ולפתולוגים בבתי החולים האוניברסיטאיים של לסטר NHS Trust על מתן רקמת גידול שנקטה בניתוח. אנו מודים גם למתקן ההיסטולוגיה בשירותי הליבה ביוטכנולוגיה על עזרה בעיבוד רקמות וחיתוך של בלוקי רקמת FFPE וקייס סטראטמן על תמיכה בשימוש ב- Vectra Polaris. מחקר זה נתמך ומומן על ידי קונסורציום Explant המורכב מארבעה שותפים: אוניברסיטת לסטר, היחידה טוקסיקולוגיה MRC, מחקר סרטן בריטניה מעבדות גילוי טיפולי, ו LifeArc. תמיכה נוספת ניתנה על ידי המרכז לרפואה ניסיונית לסרטן CRUK-NIHR לסטר (C10604/A25151). המימון ל- GM, CD ו- NA סופק על ידי תוכנית הזרז של סרטן השד עכשיו (2017NOVPCC1066), הנתמכת במימון פייזר.
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
