Explantations tumorales dérivées de patients en tant que plate-forme préclinique « vivante » pour prédire la résistance aux médicaments chez les patients
Summary
Cet article décrit les méthodes de génération, de traitement médicamenteux et d’analyse des explants dérivés du patient pour évaluer les réponses aux médicaments tumoraux dans un système de modèle préclinique vivant, pertinent pour le patient.
Abstract
La compréhension de la résistance aux médicaments et le développement de nouvelles stratégies pour sensibiliser les cancers hautement résistants reposent sur la disponibilité de modèles précliniques appropriés capables de prédire avec précision les réponses des patients. L’un des inconvénients des modèles précliniques existants est l’incapacité de préserver contextuellement le microenvironnement tumoral humain (TME) et de représenter avec précision l’hétérogénéité intratumorale, limitant ainsi la traduction clinique des données. En revanche, en représentant la culture de fragments vivants de tumeurs humaines, la plate-forme d’explant dérivé du patient (PDE) permet d’examiner les réponses médicamenteuses dans un contexte tridimensionnel (3D) qui reflète le plus fidèlement possible les caractéristiques pathologiques et architecturales des tumeurs d’origine. Des rapports antérieurs avec des PDE ont documenté la capacité de la plate-forme à distinguer les tumeurs chimiosisttives des tumeurs chimiorésistantes, et il a été démontré que cette ségrégation est prédictive des réponses des patients aux mêmes chimiothérapies. Simultanément, les PDE permettent d’interroger les caractéristiques moléculaires, génétiques et histologiques des tumeurs qui prédisent les réponses aux médicaments, identifiant ainsi des biomarqueurs pour la stratification des patients ainsi que de nouvelles approches interventionnelles pour sensibiliser les tumeurs résistantes. Cet article décrit en détail la méthodologie pdE, de la collecte d’échantillons de patients à l’analyse des critères d’évaluation. Il fournit une description détaillée des méthodes de dérivation et de culture des explants, en mettant en évidence les conditions sur mesure pour des tumeurs particulières, le cas échéant. Pour l’analyse des critères d’évaluation, l’accent est mis sur l’immunofluorescence multiplexée et l’imagerie multispectrale pour le profilage spatial de biomarqueurs clés dans les régions tumorales et stromales. En combinant ces méthodes, il est possible de générer des données quantitatives et qualitatives sur la réponse aux médicaments qui peuvent être liées à divers paramètres clinicopathologiques et donc potentiellement utilisées pour l’identification de biomarqueurs.
Introduction
Le développement d’agents anticancéreux efficaces et sûrs nécessite des modèles précliniques appropriés qui peuvent également fournir un aperçu des mécanismes d’action qui peuvent faciliter l’identification de biomarqueurs prédictifs et pharmacodynamiques. L’hétérogénéité inter- et intratumorale1,2 ,3,4,5et le TME6,7 ,8,9,10,11,12 sont connus pour influencer les réponses médicamenteuses anticancéreuses, et de nombreux modèles de cancer précliniques existants tels que les lignées cellulaires, les organoïdes et les modèles murins ne sont pas en mesure de s’adapter pleinement à ces facteurs cruciaux. fonctionnalités. Un modèle « idéal » est celui qui peut récapituler les interactions spatiales complexes des cellules malignes avec les cellules non malignes dans les tumeurs ainsi que refléter les différences régionales au sein des tumeurs. Cet article se concentre sur les PDE en tant que plate-forme émergente pouvant répondre à bon nombre de ces exigences13.
Le premier exemple de l’utilisation de PDE humains, également connus sous le nom d’histocultures, remonte à la fin des années 1980 lorsque Hoffman et al. ont généré des tranches de tumeurs humaines fraîchement réséquées et les ont cultivées dans une matrice de collagène14,15. Cela impliquait la mise en place d’un système de culture 3D qui préservait l’architecture tissulaire, assurant le maintien des composants stromaux et des interactions cellulaires au sein du TME. Sans déconstruire la tumeur d’origine, Hoffman et al.16 ont annoncé une nouvelle approche de la recherche translationnelle, et depuis ce temps, de nombreux groupes ont optimisé différentes méthodes d’explant dans le but de préserver l’intégrité des tissus et de générer des données précises sur la réponse aux médicaments17,18 , 19, 20,21,22,23,24 , bien que certaines différences entre les protocoles soient évidentes. Butler et al. ont cultivé des explants dans des éponges de gélatine pour aider à la diffusion des nutriments et des médicaments à travers le spécimen20,21,25, tandis que Majumder et al. ont créé un écosystème tumoral en cultivant des explants sur une matrice composée de protéines tumorales et stromales en présence de sérum autologue dérivé du même patient22, 23.
Plus récemment, notre groupe a mis en place un protocole par lequel les explants sont générés par fragmentation des tumeurs en morceaux de 2 à 3 mm3qui sont ensuite placés sans composants supplémentaires sur des membranes perméables à l’interface air-liquide d’un système de culture24. Prises ensemble, ces nombreuses études ont démontré que les PDE permettent la culture de fragments intacts et vivants de tumeurs humaines qui conservent l’architecture spatiale et l’hétérogénéité régionale des tumeurs d’origine. Dans les expériences originales, les explants ou les histocultures étaient généralement soumises à une homogénéisation après un traitement médicamenteux, après quoi divers tests de viabilité ont été appliqués aux échantillons homogénéisés tels que le test de réponse au médicament histoculture20,21, le test MTT (bromure de 3-(6)-2,5-diphényltétrazolium), le test de la lactate déshydrogénase ou le test à base de résazurine26,27,28 . Les progrès récents dans les techniques d’analyse des paramètres, en particulier la pathologie numérique, ont maintenant élargi le répertoire des tests et des essais des paramètres qui peuvent être effectués sur les explants29,30. Pour appliquer ces nouvelles technologies, au lieu de l’homogénéisation, les explantes sont fixées dans du formol, incorporées dans de la paraffine (FFPE) puis analysées à l’aide de techniques d’immunocoloration, permettant un profilage spatial. Des exemples de cette approche ont été documentés pour le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), le cancer du sein, le cancer colorectal et les explants de mésothéliome où la coloration immunohistochimique du marqueur de prolifération, Ki67, et du marqueur apoptotique, la poly-ADP ribose polymérase clivée (cPARP), a été utilisée pour surveiller les changements dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire24,31,32,33,34.
L’immunofluorescence multiplexée est particulièrement propice au profilage spatial des réponses médicamenteuses chez les explants au point d’extrémité35. Par exemple, il est possible de mesurer la relocalisation et la distribution spatiale de classes spécifiques de cellules immunitaires, telles que les macrophages ou les lymphocytes T, au sein du TME lorsd’untraitement médicamenteux13,36,37,38, et d’étudier si un agent thérapeutique peut favoriser la transition de la « tumeur froide » à la « tumeur chaude »39 . Au cours des dernières années, ce groupe s’est concentré sur la dérivation des PDE de différents types de tumeurs (CPNPC, cancer du rein, cancer du sein, cancer colorectal, mélanome) et sur le test d’une gamme d’agents anticancéreux, y compris les chimiothérapies, les inhibiteurs de petites molécules et les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICO). Les méthodes d’analyse des paramètres ont été optimisées pour inclure l’immunofluorescence multiplexée afin de permettre le profilage spatial des biomarqueurs pour la viabilité ainsi que des biomarqueurs pour différents constituants du TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit les méthodes de génération, de traitement médicamenteux et d’analyse des PDE et met en évidence les avantages de la plate-forme en tant que système de modèle préclinique. La culture ex vivo d’une tumeur fraîchement réséquée, qui n’implique pas sa déconstruction, permet la rétention de l’architecture tumorale13,24 et donc, les interactions spatiales des composants cellulaires dans le TME ainsi que l’hétérogénéité in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les chirurgiens et les pathologistes des hôpitaux universitaires de Leicester NHS Trust pour avoir fourni du tissu tumoral réséqué chirurgicalement. Nous remercions également l’installation d’histologie de Core Biotechnology Services pour son aide au traitement des tissus et à la section des blocs de tissus FFPE et Kees Straatman pour son soutien à l’utilisation du Vectra Polaris. Cette recherche a été soutenue et financée par le consortium Explant composé de quatre partenaires : l’Université de Leicester, l’unité de toxicologie du MRC, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories et LifeArc. Un soutien supplémentaire a été fourni par le CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Le financement des OGM, des CD et des NA a été fourni par le programme Catalyst de Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066), qui est soutenu par un financement de Pfizer.
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
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