Dit artikel beschrijft methoden voor het genereren, behandelen en analyseren van patiënt-afgeleide explantaten voor het beoordelen van tumorgeneesmiddelresponsen in een levend, patiëntrelevant, preklinisch modelsysteem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Patiënt-afgeleide tumor explanteert als een "live" preklinisch platform voor het voorspellen van medicijnresistentie bij patiënten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een goed begrip van medicijnresistentie en de ontwikkeling van nieuwe strategieën om zeer resistente kankers te sensibiliseren, is afhankelijk van de beschikbaarheid van geschikte preklinische modellen die de reacties van patiënten nauwkeurig kunnen voorspellen. Een van de nadelen van bestaande preklinische modellen is het onvermogen om de menselijke tumormicro-omgeving (TME) contextueel te behouden en de intratumorale heterogeniteit nauwkeurig weer te geven, waardoor de klinische vertaling van gegevens wordt beperkt. Door daarentegen de cultuur van levende fragmenten van menselijke tumoren weer te geven, maakt het patient-derived explant (PDE) -platform het mogelijk om medicijnresponsen te onderzoeken in een driedimensionale (3D) context die de pathologische en architecturale kenmerken van de oorspronkelijke tumoren zo goed mogelijk weerspiegelt. Eerdere rapporten met PDE's hebben het vermogen van het platform gedocumenteerd om chemosensitief van chemoresistante tumoren te onderscheiden, en het is aangetoond dat deze segregatie voorspellend is voor de reacties van patiënten op dezelfde chemotherapieën. Tegelijkertijd bieden PDE's de mogelijkheid om moleculaire, genetische en histologische kenmerken van tumoren te ondervragen die medicijnresponsen voorspellen, waardoor biomarkers voor patiëntstratificatie worden geïdentificeerd, evenals nieuwe interventionele benaderingen om resistente tumoren te sensibiliseren. Dit artikel rapporteert de PDE-methodologie in detail, van het verzamelen van patiëntmonsters tot eindpuntanalyse. Het biedt een gedetailleerde beschrijving van explantatie-afleidings- en kweekmethoden, waarbij op maat gemaakte voorwaarden voor bepaalde tumoren, waar van toepassing, worden benadrukt. Voor eindpuntanalyse is er een focus op multiplexed immunofluorescentie en multispectrale beeldvorming voor de ruimtelijke profilering van belangrijke biomarkers binnen zowel tumorale als stromale regio's. Door deze methoden te combineren, is het mogelijk om kwantitatieve en kwalitatieve geneesmiddelresponsgegevens te genereren die kunnen worden gerelateerd aan verschillende clinicopathologische parameters en dus mogelijk kunnen worden gebruikt voor biomarkeridentificatie.
Inleiding
De ontwikkeling van effectieve en veilige middelen tegen kanker vereist geschikte preklinische modellen die ook inzicht kunnen geven in werkingsmechanismen die de identificatie van voorspellende en farmacodynamische biomarkers kunnen vergemakkelijken. Inter- en intratumor heterogeniteit1,2,3,4,5 en de TME6,7,8,9,10,11....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Weefselverzameling
- Breng na de operatie vers gereseceerde menselijke tumormonsters over in een buis met 25 ml vers kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium aangevuld met 4,5 g / L glucose en L-glutamine + 1% (v / v) foetaal kalfsserum + 1% penicilline-streptomycine) en opgeslagen op ijs. Verwerk de explant binnen 2 uur na de operatie in een steriele klasse II kap.
2. Explant voorbereiding
- Reinig alle chirurgische apparatuur (grafbladen/tandwasoppervlak/pincet) met 70% industriële methyled spiritus (IMS) oplossing.
- Vul een kweekschaal van 10 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Multispectrale beeldvorming van mIF-gekleurde histologische secties maakt identificatie en fenotypering van individuele celpopulaties en identificatie van tumor- en stromale componenten in de explant TME mogelijk(figuur 2). Multispectrale beeldvorming is met name nuttig voor de analyse van weefsels met een hoge intrinsieke autofluorescentie, zoals weefsel met een hoog collageengehalte, omdat het autofluorescentiesignaal kan worden gedeconvolueerd van andere signalen en kan worden uitgesloten.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft de methoden voor generatie, medicamenteuze behandeling en analyse van PDE's en belicht de voordelen van het platform als een preklinisch modelsysteem. Ex vivo kweken van een vers gereseceerde tumor, die geen deconstructie ervan met zich meebrengt, maakt het behoud van de tumorarchitectuur13,24 en dus de ruimtelijke interacties van cellulaire componenten in de TME en intratumorale heterogeniteit mogelijk. Deze methode laat zien hoe het, met .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Niets bekend te maken
Dankbetuigingen
We bedanken de chirurgen en pathologen van de Universitaire Ziekenhuizen van Leicester NHS Trust voor het leveren van chirurgisch gereseceerd tumorweefsel. Ook danken we de histologiefaciliteit binnen Core Biotechnology Services voor hulp bij weefselverwerking en sectioning van FFPE weefselblokken en Kees Straatman voor ondersteuning bij het gebruik van de Vectra Polaris. Dit onderzoek werd ondersteund en gefinancierd door het Explant Consortium bestaande uit vier partners: de Universiteit van Leicester, de MRC Toxicology Unit, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories en LifeArc. Aanvullende ondersteuning werd geboden door het CRUK-NIHR Leicester Experime....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuur | Sigma | 320099 | Kleurstof |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antilichaam diluent/blokkeer buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citroenzuur Monohydraat | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagens voor citraat buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish voor weefselkweek |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Weefselkweek medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Monteermedium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Monteermedium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagens voor TE buffer |
| Eosine | CellPath | RBC-0100-00A | Kleurstof |
| Foetaal Rundserum | Gibco | 10500-064 | Voor gebruik in weefselkweek medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formaline |
| iGenix, magnetron IG2095 | iGenix | IG2095 | Magnetron gebruikt voor antigeen retreviaal |
| Industriële gemethyleerde spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Gedenatureerde Industriële Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automatische Vacuüm Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H en C | Leica Biosystems | Inbeddingswasbad | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Roterende microtoom | |
| Leica ST4040 Lineair Stainer | Leica Biosystems | H&E kleuringsapparaat | |
| Mayer's Haematoxyline | Sigma | GHS132-1L | Kleurstof |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrofiel PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypisch cultuur inzet disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB kleuringskit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel en TSA-DIG reagens |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymeer |
| Penicilline/streptomycine oplossing | Fisher Scientific | 11548876 | Voor gebruik in weefselkweek medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software voor gescande beelden |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorofoor verdunningsmiddel |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Monteermedium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | Om slides in Slide Carrier Hotel te laden voor scannen met Vectra Polaris | |
| Natriumchloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formaline |
| Natriumhydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagens voor citraat buffer |
| Tenatex Verharde Was - Roze (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Tandheelkundig wasoppervlak |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack voor Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Houd voor slides en slide klemmen |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide klemmen |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagens voor TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Monteermedium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Per |
Referenties
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
