Patiënt-afgeleide tumor explanteert als een "live" preklinisch platform voor het voorspellen van medicijnresistentie bij patiënten
Summary
Dit artikel beschrijft methoden voor het genereren, behandelen en analyseren van patiënt-afgeleide explantaten voor het beoordelen van tumorgeneesmiddelresponsen in een levend, patiëntrelevant, preklinisch modelsysteem.
Abstract
Een goed begrip van medicijnresistentie en de ontwikkeling van nieuwe strategieën om zeer resistente kankers te sensibiliseren, is afhankelijk van de beschikbaarheid van geschikte preklinische modellen die de reacties van patiënten nauwkeurig kunnen voorspellen. Een van de nadelen van bestaande preklinische modellen is het onvermogen om de menselijke tumormicro-omgeving (TME) contextueel te behouden en de intratumorale heterogeniteit nauwkeurig weer te geven, waardoor de klinische vertaling van gegevens wordt beperkt. Door daarentegen de cultuur van levende fragmenten van menselijke tumoren weer te geven, maakt het patient-derived explant (PDE) -platform het mogelijk om medicijnresponsen te onderzoeken in een driedimensionale (3D) context die de pathologische en architecturale kenmerken van de oorspronkelijke tumoren zo goed mogelijk weerspiegelt. Eerdere rapporten met PDE’s hebben het vermogen van het platform gedocumenteerd om chemosensitief van chemoresistante tumoren te onderscheiden, en het is aangetoond dat deze segregatie voorspellend is voor de reacties van patiënten op dezelfde chemotherapieën. Tegelijkertijd bieden PDE’s de mogelijkheid om moleculaire, genetische en histologische kenmerken van tumoren te ondervragen die medicijnresponsen voorspellen, waardoor biomarkers voor patiëntstratificatie worden geïdentificeerd, evenals nieuwe interventionele benaderingen om resistente tumoren te sensibiliseren. Dit artikel rapporteert de PDE-methodologie in detail, van het verzamelen van patiëntmonsters tot eindpuntanalyse. Het biedt een gedetailleerde beschrijving van explantatie-afleidings- en kweekmethoden, waarbij op maat gemaakte voorwaarden voor bepaalde tumoren, waar van toepassing, worden benadrukt. Voor eindpuntanalyse is er een focus op multiplexed immunofluorescentie en multispectrale beeldvorming voor de ruimtelijke profilering van belangrijke biomarkers binnen zowel tumorale als stromale regio’s. Door deze methoden te combineren, is het mogelijk om kwantitatieve en kwalitatieve geneesmiddelresponsgegevens te genereren die kunnen worden gerelateerd aan verschillende clinicopathologische parameters en dus mogelijk kunnen worden gebruikt voor biomarkeridentificatie.
Introduction
De ontwikkeling van effectieve en veilige middelen tegen kanker vereist geschikte preklinische modellen die ook inzicht kunnen geven in werkingsmechanismen die de identificatie van voorspellende en farmacodynamische biomarkers kunnen vergemakkelijken. Inter- en intratumor heterogeniteit1,2,3,4,5 en de TME6,7,8,9,10,11,12 zijn bekend om de antikankergeneesmiddelresponsen te beïnvloeden, en veel bestaande preklinische kankermodellen zoals cellijnen, organoïden en muismodellen zijn niet in staat om deze cruciale Functies. Een “ideaal” model is er een dat de complexe ruimtelijke interacties van kwaadaardige met niet-kwaadaardige cellen in tumoren kan samenvatten en de regionale verschillen binnen tumoren kan weerspiegelen. Dit artikel richt zich op PDE’s als een opkomend platform dat aan veel van deze vereisten kan voldoen13.
Het eerste voorbeeld van het gebruik van menselijke PDE’s, ook bekend als histoculturen, dateert uit de late jaren 1980 toen Hoffman et al. plakjes vers gereseceerde menselijke tumoren genereerden en ze kweekten in een collageenmatrix14,15. Dit omvatte het opzetten van een 3D-kweeksysteem dat de weefselarchitectuur bewaarde en zorgde voor het onderhoud van stromale componenten en celinteracties binnen de TME. Zonder de oorspronkelijke tumor te deconstrueren, kondigden Hoffman et al.16 een nieuwe benadering van translationeel onderzoek aan, en sinds deze tijd hebben veel groepen verschillende explantmethoden geoptimaliseerd met als doel de weefselintegriteit te behouden en nauwkeurige medicijnresponsgegevens te genereren17,18,19,20,21,22,23,24 , hoewel er duidelijke verschillen tussen protocollen zijn. Butler et al. kweekten explantaten in gelatinesponzen om de diffusie van voedingsstoffen en geneesmiddelen door het monster te helpen20,21,25, terwijl Majumder et al. een tumorecosysteem creëerden door explantaten te kweken bovenop een matrix bestaande uit tumor- en stromale eiwitten in aanwezigheid van autoloog serum afgeleid van dezelfde patiënt22, 23.
Meer recent heeft onze groep een protocol opgezet waarbij explantaten worden gegenereerd door fragmentatie van tumoren in stukken van 2 – 3 mm3-grootte die vervolgens zonder extra componenten op permeabele membranen op het lucht-vloeistof grensvlak van een kweeksysteem worden geplaatst24. Alles bij elkaar hebben deze talrijke studies aangetoond dat PDE’s de cultuur van intacte, levende fragmenten van menselijke tumoren mogelijk maken die de ruimtelijke architectuur en regionale heterogeniteit van de oorspronkelijke tumoren behouden. In oorspronkelijke experimenten werden explantaten of histoculturen meestal onderworpen aan homogenisatie na medicamenteuze behandeling, waarna verschillende levensvatbaarheidstests werden toegepast op de gehomogeniseerde monsters, zoals de histocultuurgeneesmiddelresponstest20,21,de MTT (3-(6)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) test, de lactaatdehydrogenasetest of de op resazurine gebaseerde test26,27,28 . Recente vooruitgang in eindpuntanalysetechnieken, met name digitale pathologie, heeft nu het repertoire van eindpunttests en assays uitgebreid die kunnen worden uitgevoerd op explants29,30. Om deze nieuwe technologieën toe te passen, in plaats van homogenisatie, worden explantaten gefixeerd in formaline, ingebed in paraffine (FFPE) en vervolgens geanalyseerd met behulp van immunostainingtechnieken, waardoor ruimtelijke profilering mogelijk is. Voorbeelden van deze aanpak zijn gedocumenteerd voor niet-kleincellige longkanker (NSCLC), borstkanker, colorectale kanker en mesothelioom explantaten waarbij immunohistochemische kleuring voor de proliferatiemarker Ki67 en de apoptotische marker, gekloofd poly-ADP ribose polymerase (cPARP), werd gebruikt om veranderingen in celproliferatie en celdood te volgen24,31,32,33,34.
Multiplexed immunofluorescentie is bijzonder vatbaar voor ruimtelijke profilering van geneesmiddelresponsen in explantaten op eindpunt35. Het is bijvoorbeeld mogelijk om de herlokalisatie en ruimtelijke verdeling van specifieke klassen van immuuncellen, zoals macrofagen of T-cellen, binnen de TME te meten bij medicamenteuze behandeling13,36,37,38, en te onderzoeken of een therapeutisch middel de overgang van “koude tumor” naar “hete tumor” kan bevorderen39 . In de afgelopen jaren heeft deze groep zich gericht op de afleiding van PDE’s van verschillende tumortypen (NSCLC, nierkanker, borstkanker, colorectale kanker, melanoom) en het testen van een reeks antikankermiddelen, waaronder chemotherapieën, kleinmolecuulremmers en immuuncheckpointremmers (ICI’s). Eindpuntanalysemethoden zijn geoptimaliseerd om multiplexed immunofluorescentie op te nemen om ruimtelijke profilering van biomarkers voor levensvatbaarheid en biomarkers voor verschillende bestanddelen van de TME mogelijk te maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft de methoden voor generatie, medicamenteuze behandeling en analyse van PDE’s en belicht de voordelen van het platform als een preklinisch modelsysteem. Ex vivo kweken van een vers gereseceerde tumor, die geen deconstructie ervan met zich meebrengt, maakt het behoud van de tumorarchitectuur13,24 en dus de ruimtelijke interacties van cellulaire componenten in de TME en intratumorale heterogeniteit mogelijk. Deze methode laat zien hoe het, met …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de chirurgen en pathologen van de Universitaire Ziekenhuizen van Leicester NHS Trust voor het leveren van chirurgisch gereseceerd tumorweefsel. Ook danken we de histologiefaciliteit binnen Core Biotechnology Services voor hulp bij weefselverwerking en sectioning van FFPE weefselblokken en Kees Straatman voor ondersteuning bij het gebruik van de Vectra Polaris. Dit onderzoek werd ondersteund en gefinancierd door het Explant Consortium bestaande uit vier partners: de Universiteit van Leicester, de MRC Toxicology Unit, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories en LifeArc. Aanvullende ondersteuning werd geboden door het CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Financiering voor GM, CD en NA werd verstrekt door het Catalyst Programme van Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066), dat wordt ondersteund door financiering van Pfizer.
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
