रोगी में दवा प्रतिरोध की भविष्यवाणी के लिए एक "लाइव" प्रीक्लिनिकल मंच के रूप में रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर Explants
Summary
यह पेपर एक जीवित, रोगी-प्रासंगिक, प्रीक्लिनिकल मॉडल प्रणाली में ट्यूमर दवा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न एक्सप्लांट के उत्पादन, दवा उपचार और विश्लेषण के तरीकों का वर्णन करता है।
Abstract
दवा प्रतिरोध की समझ और अत्यधिक प्रतिरोधी कैंसर को जागरूक करने के लिए उपन्यास रणनीतियों का विकास उपयुक्त प्रीक्लिनिकल मॉडल की उपलब्धता पर भरोसा करता है जो रोगी प्रतिक्रियाओं की सटीक भविष्यवाणी कर सकते हैं। मौजूदा प्रीक्लिनिकल मॉडल के नुकसान में से एक मानव ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट (टीएमई) को प्रासंगिक रूप से संरक्षित करने में असमर्थता है और इंट्राट्यूमरल विषमता का सही प्रतिनिधित्व करता है, इस प्रकार डेटा के नैदानिक अनुवाद को सीमित करता है। इसके विपरीत, मानव ट्यूमर के जीवित टुकड़ों की संस्कृति का प्रतिनिधित्व करके, रोगी-व्युत्पन्न एक्सप्लांट (पीडीई) मंच दवा प्रतिक्रियाओं को त्रि-आयामी (3 डी) संदर्भ में जांच करने की अनुमति देता है जो मूल ट्यूमर की रोग और वास्तुशिल्प विशेषताओं को यथासंभव बारीकी से प्रतिबिंबित करता है। पीडीई के साथ पिछली रिपोर्टों ने केमोरिस्ट्रिस्ट ट्यूमर से केमोसेंसिटिव को अलग करने के लिए मंच की क्षमता का दस्तावेजीकरण किया है, और यह दिखाया गया है कि यह अलगाव एक ही कीमोथेरपी के लिए रोगी प्रतिक्रियाओं का भविष्य कहनेवाला है। इसके साथ ही, पीडीई दवा प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने वाले ट्यूमर की आणविक, आनुवंशिक और हिस्टोलॉजिकल सुविधाओं से पूछताछ करने का अवसर देते हैं, जिससे प्रतिरोधी ट्यूमर को जागरूक करने के लिए रोगी स्तरीकरण के साथ-साथ उपन्यास इंटरवेंशनल दृष्टिकोणों के लिए बायोमार्कर की पहचान होती है। यह पेपर पीडीई पद्धति की विस्तार से रिपोर्ट करता है, रोगी के नमूनों के संग्रह से लेकर एंडपॉइंट विश्लेषण तक। यह एक्सप्लांट व्युत्पन्न और संस्कृति विधियों का विस्तृत विवरण प्रदान करता है, विशेष ट्यूमर के लिए बेस्पोक स्थितियों को रेखांकित करता है, जहां उचित हो। एंडपॉइंट विश्लेषण के लिए, ट्यूमर और स्ट्रोमल दोनों क्षेत्रों के भीतर प्रमुख बायोमार्कर के स्थानिक प्रोफाइलिंग के लिए मल्टीप्लेक्स्ड इम्यूनोफ्लोरेसेंस और मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित किया गया है। इन तरीकों के संयोजन से, मात्रात्मक और गुणात्मक दवा प्रतिक्रिया डेटा उत्पन्न करना संभव है जो विभिन्न चिकित्सकीय मापदंडों से संबंधित हो सकता है और इस प्रकार संभावित रूप से बायोमार्कर पहचान के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
प्रभावी और सुरक्षित कैंसर रोधी एजेंटों के विकास के लिए उपयुक्त प्रीक्लिनिकल मॉडल की आवश्यकता होती है जो कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि भी प्रदान कर सकते हैं जो भविष्य कहनेवाला और फार्माकोडायनामिक बायोमार्कर की पहचान की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। अंतर और इंट्राट्यूमर विषमता1,2,3,4,5 और टीएमई6,7,8,9,10,11, 12कैंसर रोधी दवा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं, और सेल लाइनों, ऑर्गेनॉइड और माउस मॉडल जैसे कई मौजूदा प्रीक्लिनिकल कैंसर मॉडल पूरीतरह से इन महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण को समायोजित करने में सक्षम नहीं हैं सुविधाऐं। एक “आदर्श” मॉडल एक है कि ट्यूमर के भीतर गैर घातक कोशिकाओं के साथ घातक के जटिल स्थानिक बातचीत संक्षिप्त कर सकते है और साथ ही ट्यूमर के भीतर क्षेत्रीय मतभेदों को प्रतिबिंबित । यह लेख पीडीई पर एक उभरते मंच के रूप में केंद्रित है जो इनमें से कई आवश्यकताओं को पूरा कर सकता है13.
मानव पीडीई के उपयोग का पहला उदाहरण, जिसे हिस्टोकल्चर के रूप में भी जाना जाता है, 1 9 80 के दशक के उत्तरार्ध में है जब हॉफमैन एट अल ने हौसले से पुनः प्राप्त मानव ट्यूमर के स्लाइस उत्पन्न किए और उन्हें कोलेजन मैट्रिक्स14,15में सुसंस्कृत किया। इसमें एक 3 डी संस्कृति प्रणाली स्थापित करना शामिल था जो ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करता है, जो टीएमई के भीतर स्ट्रोमल घटकों और सेल इंटरैक्शन के रखरखाव को सुनिश्चित करता है। मूल ट्यूमर को विघटित किए बिना, हॉफमैन एटअल16 ने ट्रांसलेशनल रिसर्च के एक नए दृष्टिकोण की शुरुआत की, और इस समय से, कई समूहों ने ऊतक अखंडता को संरक्षित करने और सटीक दवा प्रतिक्रिया डेटा17, 18, 19,20,21,22, 23,24बनाने के उद्देश्य से विभिन्न एक्सप्लांट तरीकों को अनुकूलित किया है। , हालांकि प्रोटोकॉल के बीच कुछ मतभेद स्पष्ट हैं । बटलर एट अल. नमूने के माध्यम से पोषक तत्वों और दवाओं के प्रसार में मदद करने के लिए जिलेटिन स्पंज में सुसंस्कृत explants20,21,25,जबकि मजूमडर एट अल. एक ही रोगी22से प्राप्त ऑटोलॉगस सीरम की उपस्थिति में ट्यूमर और स्ट्रोमल प्रोटीन से बना मैट्रिक्स के शीर्ष पर explants खेती द्वारा एक ट्यूमर पारिस्थितिकी तंत्र बनाया, 23.
हाल ही में, हमारे समूह ने एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है जिससे ट्यूमर के विखंडन से 2-3 मिमी3आकार के टुकड़े उत्पन्न होते हैं जो तब संस्कृति प्रणाली24के वायु-तरल इंटरफ़ेस पर पारमीय झिल्ली पर अतिरिक्त घटकों के बिना रखे जाते हैं। एक साथ लिया, इन कई अध्ययनों से पता चला है कि पीडीई मानव ट्यूमर के अक्षुण्ण, जीवित टुकड़े की संस्कृति की अनुमति देते हैं जो स्थानिक वास्तुकला और मूल ट्यूमर की क्षेत्रीय विषमता को बनाए रखते हैं। मूल प्रयोगों में, एक्सप्लांट या हिस्टोकल्चर आमतौर पर दवा उपचार के बाद समरूपता के अधीन होते थे, जिसके बाद विभिन्न व्यवहार्यता परख को समरूप नमूनों जैसे हिस्टोकल्चर ड्रग रिस्पांस परख20,21,एमटीटी (3-(6) -2,5-डिफेनिल्टेट्राजोलम ब्रोमाइड) परख, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज परख, या रेसज़िन आधारित परख26,27, 28परी के रूप में लागू किया गया था। . एंडपॉइंट विश्लेषण तकनीकों, विशेष रूप से डिजिटल पैथोलॉजी में हाल की प्रगति ने अब एंडपॉइंट परीक्षणों और परखों के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार किया है जो29,30के एक्सप्लांट्स पर किया जा सकता है। इन नई प्रौद्योगिकियों को लागू करने के लिए, समरूपता के बजाय, पैराफिन (एफएफपीई) में एम्बेडेड फॉर्मेलिन में एक्सप्लांट तय किए जाते हैं और फिर इम्यूनोस्टेटिंग तकनीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है, जिससे स्थानिक प्रोफाइलिंग की अनुमति होती है। इस दृष्टिकोण के उदाहरण गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी), स्तन कैंसर के लिए प्रलेखित किया गया है, कोलोरेक्टल कैंसर, और मेसोथेलियोमा एक्सप्लांट्स जिससे प्रसार मार्कर, Ki67, और एपोप्टोटिक मार्कर, क्लीव्ड पॉली-एडीपी रिबोज़ पॉलीमरेज (सीपीआरपी) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला, सेल प्रसार औरसेल डेथ24,31, 32,33,34में परिवर्तन की निगरानी के लिए उपयोग किया गया था।
मल्टीप्लेक्स्ड इम्यूनोफ्लोरेसेंस विशेष रूप से एंडपॉइंट35पर एक्सप्लांट में दवा प्रतिक्रियाओं की स्थानिक प्रोफाइलिंग के लिए उत्तरदायी है। उदाहरण केलिए, दवा उपचार13, 36, 37, 38पर TME के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट वर्गों, जैसे मैक्रोफेज या टी कोशिकाओं के पुनर्लोकीकरण और स्थानिक वितरण को मापना संभव है, और जांच करना कि क्या एक चिकित्सीय एजेंट “कोल्ड ट्यूमर” से “हॉट ट्यूमर”39 में संक्रमण का पक्ष ले सकता है . हाल के वर्षों में, इस समूह ने विभिन्न ट्यूमर प्रकारों (एनएससीएलसी, गुर्दे का कैंसर, स्तन कैंसर, कोलोरेक्टल कैंसर, मेलानोमा) और कीमोथेरपी, छोटे-अणु अवरोधकों और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों (ICIs) सहित एंटीकैंसर एजेंटों की एक श्रृंखला के परीक्षण से पीडीई के व्युत्पन्न पर ध्यान केंद्रित किया है। टीएमई के विभिन्न घटकों के लिए व्यवहार्यता के साथ-साथ बायोमार्कर के स्थानिक प्रोफाइलिंग की अनुमति देने के लिए मल्टीप्लेक्स्ड इम्यूनोफ्लोरेसेंस को शामिल करने के लिए एंडपॉइंट विश्लेषण विधियों को अनुकूलित किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर पीडीई के उत्पादन, दवा उपचार और विश्लेषण के तरीकों का वर्णन करता है और मंच के फायदों को एक प्रीक्लिनिकल मॉडल सिस्टम के रूप में उजागर करता है। एक हौसले से पुनः प्राप्त ट्यूमर की पूर्व वीवो संस्कृत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सर्जिकल पुनः प्राप्त ट्यूमर ऊतक प्रदान करने के लिए लीसेस्टर एनएचएस ट्रस्ट के विश्वविद्यालय अस्पतालों में सर्जन और रोगविज्ञानियों का शुक्रिया अदा करते हैं । हम वेक्ट्रा पोलारिस के उपयोग के समर्थन के लिए ऊतक प्रसंस्करण और एफएफपीई ऊतक ब्लॉकों और कीस स्ट्रैटमैन की अनुभागिंग के साथ मदद के लिए कोर बायोटेक्नोलॉजी सेवाओं के भीतर हिक्टोलॉजी सुविधा का भी धन्यवाद करते हैं। इस शोध का समर्थन किया गया था और चार भागीदारों को शामिल करते हुए Explant कंसोर्टियम द्वारा वित्त पोषित किया गया था: लीसेस्टर विश्वविद्यालय, एमआरसी टॉक्सिकोलॉजी यूनिट, कैंसर रिसर्च यूके चिकित्सीय डिस्कवरी प्रयोगशालाएं, और लाइफआरआरसी। CRUK-NIHR लीसेस्टर प्रायोगिक कैंसर चिकित्सा केंद्र (C10604/A25151) द्वारा अतिरिक्त सहायता प्रदान की गई थी । जीएम, सीडी, और एनए के लिए धन स्तन कैंसर अब उत्प्रेरक कार्यक्रम (2017NOVPCC1066) द्वारा प्रदान किया गया था, जो फाइजर से धन द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
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