Pasientavledede tumor utviser som en "levende" preklinisk plattform for å forutsi legemiddelresistens hos pasienter
Summary
Dette dokumentet beskriver metoder for generering, legemiddelbehandling og analyse av pasientavledede utvisningsmodeller for å vurdere tumormedisinske responser i et levende, pasientrelevant, preklinisk modellsystem.
Abstract
En forståelse av legemiddelresistens og utvikling av nye strategier for å sensibilisere svært resistente kreftformer er avhengig av tilgjengeligheten av egnede prekliniske modeller som nøyaktig kan forutsi pasientresponser. En av ulempene ved eksisterende prekliniske modeller er manglende evne til kontekstuelt å bevare det menneskelige tumormikromiljøet (TME) og nøyaktig representere intratumoral heterogenitet, og dermed begrense den kliniske oversettelsen av data. Til sammenligning, ved å representere kulturen av levende fragmenter av menneskelige svulster, tillater den pasientavledede explant (PDE) plattformen narkotikaresponser å bli undersøkt i en tredimensjonal (3D) kontekst som speiler de patologiske og arkitektoniske egenskapene til de opprinnelige svulstene så nært som mulig. Tidligere rapporter med PDEer har dokumentert plattformens evne til å skille chemosensitive fra chemoresistant svulster, og det har vist seg at denne segregeringen er prediktiv for pasientresponser på de samme kjemoterapiene. Samtidig tillater PDEer muligheten til å forhøre molekylære, genetiske og histologiske trekk ved svulster som forutsier legemiddelresponser, og dermed identifisere biomarkører for pasientstratifisering samt nye intervensjonelle tilnærminger for å sensibilisere resistente svulster. Dette dokumentet rapporterer PDE-metodikk i detalj, fra innsamling av pasientprøver til endepunktanalyse. Det gir en detaljert beskrivelse av eklant avledning og kulturmetoder, og fremhever skreddersydde forhold for bestemte svulster, der det er hensiktsmessig. For endepunktanalyse er det fokus på multiplekset immunfluorescens og multispektral avbildning for romlig profilering av viktige biomarkører innenfor både tumor- og stromale regioner. Ved å kombinere disse metodene er det mulig å generere kvantitative og kvalitative legemiddelresponsdata som kan relateres til ulike klinopatiske parametere og dermed potensielt brukes til biomarkøridentifikasjon.
Introduction
Utviklingen av effektive og sikre anticancer agenter krever passende prekliniske modeller som også kan gi innsikt i virkningsmekanismer som kan lette identifisering av prediktive og farmakodynamiske biomarkører. Inter- og intratumor heterogenitet1,2,3,4,5 og TME6,7,8,9,10,11,12 er kjent for å påvirke anticancer narkotikaresponser, og mange eksisterende prekliniske kreftmodeller som cellelinjer, organoider og musemodeller er ikke i stand til å imøtekomme disse avgjørende Funksjoner. En “ideell” modell er en som kan rekapitulere de komplekse romlige interaksjonene mellom ondartede med ikke-ondartede celler i svulster, samt reflektere de regionale forskjellene innen svulster. Denne artikkelen fokuserer på PDEer som en ny plattform som kan oppfylle mange av disse kravene13.
Det første eksemplet på bruk av menneskelige PDEer, også kjent som histokulturer, dateres tilbake til slutten av 1980-tallet da Hoffman et al. genererte skiver av nyoppussede menneskelige svulster og dyrket dem i en kollagenmatrise14,15. Dette innebar å etablere et 3D-kultursystem som bevarte vevsarkitektur, og sikret vedlikehold av stromale komponenter og celleinteraksjoner i TME. Uten å dekonstruere den opprinnelige svulsten, varslet Hoffman et al.16 en ny tilnærming til translasjonell forskning, og siden denne gangen har mange grupper optimalisert forskjellige explantmetoder med sikte på å bevare vevsintegriteten og generere nøyaktige legemiddelresponsdata17,18,19,20,21,22,23,24 , selv om det er tydelige forskjeller mellom protokoller. Butler et al. dyrket explants i gelatin svamper for å hjelpe diffusjon av næringsstoffer og stoffer gjennom prøven20,21,25, mens Majumder et al. opprettet et tumorøkosystem ved å dyrke explants på toppen av en matrise sammensatt av svulst og stromale proteiner i nærvær av autologt serum avledet fra samme pasient22, 23.
Mer nylig satte gruppen vår opp en protokoll der explants genereres ved fragmentering av svulster i 2 – 3 mm3-størrelsestykker som deretter plasseres uten ekstra komponenter på gjennomtrengelige membraner ved luftvæskegrensesnittet til et kultursystem24. Samlet sett har disse mange studiene vist at PDEer tillater kulturen av intakte, levende fragmenter av menneskelige svulster som beholder den romlige arkitekturen og den regionale heterogeniteten til de opprinnelige svulstene. I originale eksperimenter ble explants eller histokulturer vanligvis utsatt for homogenisering etter legemiddelbehandling, hvoretter ulike levedyktighetsanalyser ble brukt på de homogeniserte prøvene som histokulturens legemiddelresponsanalyse20,21, MTT (3-(6)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) analyse, laktat dehydrogenaseanalysen eller den resazurinbaserte analysen26,27, 28,28 . Nylig fremgang i endepunktanalyseteknikker, spesielt digital patologi, har nå utvidet repertoaret til endepunktstester og analyser som kan utføres på explants29,30. For å bruke disse nye teknologiene, i stedet for homogenisering, er explants festet i formalin, innebygd i paraffin (FFPE) og deretter analysert ved hjelp av immundempende teknikker, slik at romlig profilering. Eksempler på denne tilnærmingen er dokumentert for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), brystkreft, kolorektal kreft, og mesothelioma utviser der immunhiistokjemisk farging for spredningsmarkøren, Ki67, og apoptotisk markør, spaltet poly-ADP ribosepolymerase (cPARP), ble brukt til å overvåke endringer i celleproliferasjon og celledød24,31,32,33,34.
Multiplekset immunfluorescens er spesielt egnet for romlig profilering av legemiddelresponser i utvisning ved endepunkt35. For eksempel er det mulig å måle omfordeling og romlig fordeling av spesifikke klasser av immunceller, for eksempel makrofager eller T-celler, innenfor TME ved legemiddelbehandling13,36,37,38, og undersøke om et terapeutisk middel kan favorisere overgangen fra “kald svulst” til “varm svulst”39 . De siste årene har denne gruppen fokusert på avledning av PDEer fra forskjellige tumortyper (NSCLC, nyrekreft, brystkreft, kolorektal kreft, melanom) og testing av en rekke anticancer-midler, inkludert kjemoterapier, småmolekylhemmere og immunkontrollpunkthemmere (ICIer). Endepunktanalysemetoder er optimalisert for å inkludere multiplekset immunfluorescens for å tillate romlig profilering av biomarkører for levedyktighet samt biomarkører for forskjellige bestanddeler av TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen beskriver metodene for generering, narkotikabehandling og analyse av PDEer og fremhever fordelene ved plattformen som et preklinisk modellsystem. Ex vivo culturing av en nyoppusset svulst, som ikke involverer dens dekonstruksjon, tillater oppbevaring av tumorarkitekturen13,24 og dermed de romlige interaksjonene mellom cellulære komponenter i TME samt intratumoral heterogenitet. Denne metoden demonstrerer hvordan, ved hjelp av en tumorspesifikk m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker kirurgene og patologene ved Universitetssykehusene i Leicester NHS Trust for å ha gitt kirurgisk resected tumorvev. Vi takker også histologianlegget i Core Biotechnology Services for hjelp med vevsbehandling og seksjonering av FFPE vevsblokker og Kees Straatman for støtte ved bruk av Vectra Polaris. Denne forskningen ble støttet og finansiert av Explant Consortium bestående av fire partnere: University of Leicester, THE MRC Toxicology Unit, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories og LifeArc. Ytterligere støtte ble gitt av CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Støtten til GM, CD og NA ble levert av Breast Cancer Now’s Catalyst Program (2017NOVPCC1066), som støttes av finansiering fra Pfizer.
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
