Caracterización funcional de variantes de RYR1 humanas expresadas endógenamente
Summary
Aquí se describen los métodos utilizados para estudiar el efecto funcional de las mutaciones RYR1 expresadas endógenamente en los linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y las células satélite derivadas de biopsia muscular diferenciadas en miotubos.
Abstract
Se han identificado más de 700 variantes en el gen RYR1 en pacientes con diferentes trastornos neuromusculares incluyendo susceptibilidad a hipertermias malignas, miopatías centrales y miopatía centronuclear. Debido a los diversos fenotipos vinculados a las mutaciones RYR1 es fundamental caracterizar sus efectos funcionales para clasificar las variantes que portan los pacientes para futuras intervenciones terapéuticas e identificar variantes no patógenas. Muchos laboratorios se han interesado en desarrollar métodos para caracterizar funcionalmente las mutaciones RYR1 expresadas en las células de los pacientes. Este enfoque tiene numerosas ventajas, que incluyen: las mutaciones se expresan endógenamente, RyR1 no se sobreexpresa, se evita el uso de células heterólogas que expresan RyR1. Sin embargo, dado que los pacientes pueden presentar mutaciones en diferentes genes aparte de RYR1, es importante comparar los resultados del material biológico de individuos que albergan la misma mutación, con diferentes antecedentes genéticos. El presente manuscrito describe métodos desarrollados para estudiar los efectos funcionales de las variantes RYR1 expresadas endógenamente en: (a) linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y (b) células satélite derivadas de biopsias musculares y diferenciadas en miotubos. Luego se monitorean los cambios en la concentración intracelular de calcio desencadenados por la adición de un activador farmacológico de RyR1. El tipo de célula seleccionado está cargado con un indicador de calcio fluorescente ratiométrico y los cambios intracelulares [Ca2+] se monitorean a nivel de una sola célula mediante microscopía de fluorescencia o en poblaciones celulares utilizando un espectrofluorómetro. Las curvas de respuesta a dosis agonistas en reposo [Ca2+],se comparan entre las células de los controles sanos y los pacientes que albergan variantes de RYR1, lo que lleva a una idea del efecto funcional de una variante dada.
Introduction
Hasta la fecha, se han identificado más de 700 variantes de RYR1 en la población humana y se han relacionado con diversos trastornos neuromusculares, incluida la susceptibilidad a la hipertermia maligna (MHS), la rabdomiólisis inducida por el ejercicio, la enfermedad del núcleo central (CCD), la enfermedad multi-minicore (MmD), la miopatía centronuclear (CNM)1,2,3 ; sin embargo, los estudios para caracterizar sus efectos funcionales están rezagados y solo aproximadamente el 10% de las mutaciones se han probado funcionalmente. Se pueden utilizar diferentes enfoques experimentales para evaluar el impacto de una variante RyR1 dada, incluida la transfección de células heterólogas como las células HEK293 y COS-7 con plásmido que codifica para el WT y el mutante RYR1 cDNA4,5, transducción de fibroblastos de ratón dispédicos con plásmidos y vectores que codifican para el WT y mutante RYR1 cDNA, seguido de transducción con myo-D y diferenciación en miotubos6 , generación de modelos animales transgénicos portadores de mutantes RyR1s7,8,9, caracterización de células de pacientes que expresan la variante RYR1 endógenamente10,11,12. Tales métodos han ayudado a establecer cómo las diferentes mutaciones afectan funcionalmente el canal RyR1 Ca2+.
Aquí, se describen los métodos desarrollados para evaluar los efectos funcionales de las mutaciones de RYR1. Se investigan varios parámetros de la homeostasis del calcio intracelular en células humanas que expresan endógenamente el canal de calcio RyR1, incluidos los miotubos y los linfocitos B inmortalizados por el virus de Epstein Barr (VEB). Las células se obtienen de los pacientes, se expanden en cultivo y se cargan con indicadores de calcio fluorescentes ratiométricos como Fura-2 o indo-1. Los parámetros que se ha informado que están alterados debido a mutaciones patógenas de RYR1, incluido el reposo [Ca2+],la sensibilidad a diferentes agonistas farmacológicos y el tamaño de las reservas intracelulares de Ca2+ se miden a nivel de una sola célula, utilizando microscopía de fluorescencia, o en poblaciones celulares utilizando un fluorímetro. Los resultados obtenidos en células de portadores de mutaciones se comparan con los obtenidos de miembros sanos de la familia de control. Este enfoque ha demostrado que: (i) muchas mutaciones relacionadas con MHS conducen a un aumento en el reposo [Ca2+] y un desplazamiento hacia la izquierda en la curva de dosis-respuesta a la despolarización inducida por KCl o a la activación farmacológica de RyR1 con 4-cloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) las mutaciones relacionadas con CCD conducen a una disminución en el pico [Ca2+] liberado por activación farmacológica del RyR1 y a una disminución del tamaño si el Ca2+ intracelular almacena12,13,14,15; (iii) algunas variantes no afectan a la homeostasis de Ca2+13. Las ventajas de este enfoque experimental son: la proteína RyR1 no está sobreexpresada y los niveles fisiológicos están presentes, las células pueden ser inmortalizadas (tanto las células musculares como los linfocitos B) proporcionando líneas celulares que contienen mutaciones. Algunas desventajas se relacionan con el hecho de que los pacientes pueden portar mutaciones en más de un gen que codifica proteínas involucradas en la homeostasis del calcio y / o el acoplamiento de contracción de excitación (ECC) y esto puede complicar las conclusiones experimentales. Por ejemplo, se identificaron dos variantes de JP-45 en la población MHS y control y se demostró que su presencia impacta la sensibilidad del receptor de dihidropiridina (DHPR) a la activación16. Los pacientes deben estar disponibles, el material biológico debe ser recién recolectado y los permisos éticos deben obtenerse de las juntas éticas locales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos descritos en este artículo han sido utilizados con éxito por varios laboratorios para estudiar el impacto de las mutaciones RYR1 en la homeostasis del calcio. Los pasos críticos de los enfoques descritos en este documento se refieren a la esterilidad, las habilidades y técnicas de cultivo celular y la disponibilidad de material biológico. En principio, el uso de linfocitos B inmortalizados por EBV es más simple y permite generar líneas celulares que contienen canales RyR1 mutantes. Las células se p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo descrito en este manuscrito fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (SNF) y la Fundación Suiza del Músculo.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
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