Funktionel karakterisering af endogene udtrykte humane RYR1 Varianter
Summary
Her beskrives metoder, der anvendes til at studere den funktionelle effekt af RYR1-mutationer, der endogne udtrykkes i Epstein Barr Virus, humane B-lymfocytter og muskelbiopsi afledte satellitceller, der er differentieret i myotubes.
Abstract
Mere end 700 varianter i RYR1-genet er blevet identificeret hos patienter med forskellige neuromuskulære lidelser, herunder ondartet hypertermi modtagelighed, kerne myopatier og centronuclear myopati. På grund af de forskellige fænotyper forbundet med RYR1 mutationer er det afgørende at karakterisere deres funktionelle virkninger til at klassificere varianter båret af patienter til fremtidige terapeutiske interventioner og identificere ikke-patogene varianter. Mange laboratorier har været interesseret i at udvikle metoder til funktionelt at karakterisere RYR1 mutationer udtrykt i patienternes celler. Denne tilgang har mange fordele, herunder: mutationer udtrykkes endogene, RyR1 er ikke over-udtrykt, brug af heterologe RyR1 udtrykke celler undgås. Men da patienter kan præsentere mutationer i forskellige gener bortset ryr1, er det vigtigt at sammenligne resultater fra biologisk materiale fra personer, der huser den samme mutation, med forskellige genetiske baggrunde. Dette manuskript beskriver metoder udviklet til at studere de funktionelle virkninger af endogene udtrykte RYR1 varianter i: (a) Epstein Barr virus udødeliggjort menneskelige B-lymfocytter og (b) satellitceller stammer fra muskelbiopsier og differentieret i myotubes. Ændringer i den intracellulære calciumkoncentration udløst af tilsætning af en farmakologisk RyR1-aktivatorer overvåges derefter. Den valgte celletype er fyldt med en ratiometrisk fluorescerende calciumindikator, og intracellulære [Ca2+]-ændringerovervåges enten på enkeltcelleniveau ved fluorescensmikroskopi eller i cellepopulationer ved hjælp af et spektrfluorometer. Hvile [Ca2 +], agonistiske dosis respons kurver er derefter sammenlignet mellem celler fra sunde kontroller og patienter huser RYR1 varianter fører til indsigt i den funktionelle effekt af en given variant.
Introduction
Til dato er der identificeret mere end 700 RYR1-varianter i den menneskelige befolkning og forbundet med forskellige neuromuskulære lidelser, herunder ondartet hypertermifølsomhed (MHS), motion induceret rhabdomyolyse, central kernesygdom (CCD), multi-minicore sygdom (MMD), centronuclear myopati (CNM)1,2,3 ; ikke desto mindre er undersøgelser for at karakterisere deres funktionelle virkninger bagud, og kun ca. 10% af mutationerne er blevet testet funktionelt. Forskellige eksperimentelle tilgange kan bruges til at vurdere virkningen af en given RyR1 variant, herunder transfection af heterologe celler såsom HEK293 og COS-7 celler med plasmid kodning for WT og mutant RYR1 cDNA4,5, transduktion af dyspede mus fibroblaster med plasmider og vektorer kodning for WT og mutant RYR1 cDNA, efterfulgt af transduktion med myo-D og differentiering i myotubes6 , generering af transgene dyremodeller , der bærer mutant ryR1s7,8,9, karakterisering af celler fra patienter , der udtrykker RYR1-varianten endogene10,11,12. Sådanne metoder har hjulpet med at fastslå, hvordan forskellige mutationer funktionelt påvirker RyR1 Ca2 + kanalen.
Her beskrives metoder udviklet til at vurdere de funktionelle virkninger af RYR1-mutationer. Forskellige parametre for intracellulær calcium homøostase undersøges i menneskelige celler endogent udtrykke RyR1 calcium kanal, herunder myotubes og Epstein Barr Virus (EBV) udødeliggjort B-lymfocytter. Celler er fremstillet af patienter, udvidet i kultur og fyldt med ratiometriske fluorescerende calcium indiktorer såsom Fura-2 eller indo-1. Parametre, der er rapporteret at blive ændret på grund af patogene RYR1-mutationer, herunder hvile [Ca2+], følsomheden over for forskellige farmakologiske agonister og størrelsen af de intracellulære Ca2+-lagre måles enten på enkeltcelleniveau ved hjælp af fluorescensmikroskopi eller i cellepopulationer ved hjælp af et fluormeter. Resultater opnået i celler fra mutation bærere er derefter sammenlignet med dem, der opnås fra sunde kontrol familiemedlemmer. Denne fremgangsmåde har vist, at: i) mange mutationer forbundet med MHS fører til en stigning i hvile [Ca2+] og et skift til venstre i dosisresponskurven til enten KCl-induceret depolarisering eller farmakologisk RyR1-aktivering med 4-chloro-m-cresol10,11,12,13; ii) mutationer i forbindelse med CCD fører til et fald i toppen [Ca2+],der frigives ved farmakologisk aktivering af RyR1 og nedsættes, hvis det intracellulære Ca2+-område lagrer12,13,14,15; iii) nogle varianter påvirker ikke Ca2+ homøostase13. Fordelene ved denne eksperimentelle tilgang er: RyR1-proteinet er ikke over udtrykt, og fysiologiske niveauer er til stede, celler kan udødeliggøres (både muskelceller og B-lymfocytter), der giver cellelinjer, der indeholder mutationer. Nogle ulemper vedrører det faktum, at patienter kan bære mutationer i mere end ét genkodning af proteiner, der er involveret i calcium homøostase og /eller excitation sammentrækning kobling (ECC), og dette kan komplicere eksperimentelle konklusioner. For eksempel blev to JP-45 varianter identificeret i MHS og kontrolpopulationen, og deres tilstedeværelse viste sig at påvirke følsomheden af dihydropyridinreceptoren (DHPR) til aktivering16. Patienterne skal være til rådighed, biologisk materiale skal indsamles frisk, og etiske tilladelser skal indhentes fra de lokale etiske bestyrelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollerne beskrevet i dette papir er blevet udnyttet med succes af flere laboratorier til at studere virkningen af RYR1 mutationer på calcium homøostase. De kritiske trin i de tilgange, der er skitseret i dette dokument, vedrører sterilitet, cellekulterende færdigheder og teknikker og tilgængelighed af biologisk materiale. I princippet er brugen af EBV-udødeliggjorte B-lymfocytter enklere og gør det muligt at generere cellelinjer, der indeholder mutante RyR1-kanaler. Cellerne kan fryses og opbevares i flydende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det arbejde, der er beskrevet i dette manuskript blev støttet af tilskud fra Swiss National Science Foundation (SNF) og den schweiziske Muscle Foundation.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
