Funksjonell karakterisering av endogene uttrykte humane RYR1-varianter
Summary
Her metoder som brukes til å studere den funksjonelle effekten av RYR1 mutasjoner endogent uttrykt i Epstein Barr Virus udødeliggjort menneskelig B-lymfocytter og muskelbiopsi avledet satellittceller differensiert i myotubes er beskrevet.
Abstract
Mer enn 700 varianter i RYR1-genet er identifisert hos pasienter med forskjellige nevromuskulære lidelser, inkludert ondartet hypertermi mottakelighet, kjernemyopatier og centronuclear myopati. På grunn av de forskjellige fenotypene knyttet til RYR1-mutasjoner er det grunnleggende å karakterisere deres funksjonelle effekter for å klassifisere varianter som bæres av pasienter for fremtidige terapeutiske inngrep og identifisere ikke-patogene varianter. Mange laboratorier har vært interessert i å utvikle metoder for å funksjonelt karakterisere RYR1-mutasjoner uttrykt i pasientens celler. Denne tilnærmingen har mange fordeler, inkludert: mutasjoner uttrykkes endogært, RyR1 er ikke over-uttrykt, bruk av heterologe RyR1 uttrykkende celler unngås. Men siden pasienter kan presentere mutasjoner i forskjellige gener til side RYR1, er det viktig å sammenligne resultater fra biologisk materiale fra individer som har samme mutasjon, med forskjellig genetisk bakgrunn. Det nåværende manuskriptet beskriver metoder utviklet for å studere de funksjonelle effektene av endogene uttrykte RYR1-varianter i: (a) Epstein Barr-virus udødeliggjorte humane B-lymfocytter og (b) satellittceller avledet fra muskelbiopsier og differensiert i myotubes. Endringer i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen utløst av tilsetning av en farmakologisk RyR1-aktivatorer overvåkes deretter. Den valgte celletypen er lastet med en forholdsmetrisk fluorescerende kalsiumindikator og intracellulære [Ca2+] endringer overvåkes enten på enkeltcellenivå ved fluorescensmikroskopi eller i cellepopulasjoner ved hjelp av et spektrofluorometer. Hvilen [Ca2+], agonistiske doseresponskurver sammenlignes deretter mellom celler fra sunne kontroller og pasienter som har RYR1-varianter som fører til innsikt i den funksjonelle effekten av en gitt variant.
Introduction
Til dags dato har mer enn 700 RYR1-varianter blitt identifisert i den menneskelige befolkningen og knyttet til ulike nevromuskulære lidelser, inkludert ondartet hypertermi mottakelighet (MHS), treningsindusert rabdomyolyse, sentral kjernesykdom (CCD), multi-minicore sykdom (MmD), centronuclear myopati (CNM)1,2,3 ; Likevel henger studier for å karakterisere deres funksjonelle effekter, og bare ca. 10% av mutasjonene har blitt testet funksjonelt. Ulike eksperimentelle tilnærminger kan brukes til å vurdere virkningen av en gitt RyR1-variant, inkludert transfeksjon av heterologiske celler som HEK293 og COS-7 celler med plasmid koding for WT og mutant RYR1 cDNA4,5, transduksjon av dyspediske musfibroblaster med plasmider og vektorer koding for WT og mutant RYR1 cDNA, etterfulgt av transduksjon med myo-D og differensiering i myotubes6 , generasjon av transgene dyremodeller som bærer mutant RyR1s7,8,9, karakterisering av celler fra pasienter som uttrykker RYR1-varianten endogent10,11,12. Slike metoder har bidratt til å fastslå hvordan forskjellige mutasjoner funksjonelt påvirker RyR1 Ca2+ kanalen.
Her beskrives metoder utviklet for å vurdere funksjonelle effekter av RYR1 mutasjoner. Ulike parametere av intracellulær kalsium homeostase undersøkes i humane celler endogent uttrykker RyR1 kalsiumkanal, inkludert myotubes og Epstein Barr Virus (EBV) udødeliggjort B-lymfocytter. Celler er hentet fra pasienter, utvidet i kultur og lastet med rasjonmetrisk fluorescerende kalsiumindiktorer som Fura-2 eller indo-1. Parametere som har blitt rapportert å bli endret på grunn av patogene RYR1-mutasjoner, inkludert hvile [Ca2+], følsomheten til forskjellige farmakologiske agonister og størrelsen på de intracellulære Ca2 + -butikkene måles enten på enkeltcellenivå, ved hjelp av fluorescensmikroskopi eller i cellepopulasjoner ved hjelp av et fluorimeter. Resultater oppnådd i celler fra mutasjonsbærere sammenlignes deretter med de som er oppnådd fra friske kontrollfamiliemedlemmer. Denne tilnærmingen har vist at: (i) mange mutasjoner knyttet til MHS fører til en økning i hvilen [Ca2+] og et skifte til venstre i doseresponskurven til enten KCl-indusert depolarisering eller farmakologisk RyR1-aktivering med 4-kloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) mutasjoner knyttet til CCD fører til en reduksjon i toppen [Ca2 +] utgitt ved farmakologisk aktivering av RyR1 og redusert størrelse hvis den intracellulære Ca2 + lagrer12,13,14,15; (iii) noen varianter påvirker ikke Ca2+ homeostase13. Fordelene med denne eksperimentelle tilnærmingen er: RyR1-proteinet er ikke over-uttrykt og fysiologiske nivåer er til stede, celler kan udødeliggjøres (både muskelceller og B-lymfocytter) som gir cellelinjer som inneholder mutasjoner. Noen ulemper er knyttet til det faktum at pasienter kan bære mutasjoner i mer enn ett genkodingsproteiner involvert i kalsium homeostase og / eller eksitasjonskontraksjonskobling (ECC), og dette kan komplisere eksperimentelle konklusjoner. For eksempel ble to JP-45-varianter identifisert i MHS og kontrollpopulasjonen, og deres tilstedeværelse ble vist å påvirke følsomheten til dihydropyridinreseptoren (DHPR) til aktivering16. Pasienter må være tilgjengelige, biologisk materiale må samles inn på nytt og etiske tillatelser må innhentes fra de lokale etiske styrene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollene beskrevet i denne artikkelen har blitt brukt av flere laboratorier for å studere effekten av RYR1 mutasjoner på kalsium homeostase. De kritiske trinnene i tilnærmingene som er skissert i dette dokumentet, omhandler sterilitet, cellekulturferdigheter og teknikker og tilgjengelighet av biologisk materiale. I prinsippet er bruken av EBV-udødelige B-lymfocytter enklere og gjør det mulig å generere cellelinjer som inneholder mutante RyR1-kanaler. Cellene kan fryses og lagres i flytende nitrogen i mange år,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Verket som er beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av tilskudd fra Swiss National Science Foundation (SNF) og Swiss Muscle Foundation.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
