Her metoder som brukes til å studere den funksjonelle effekten av RYR1 mutasjoner endogent uttrykt i Epstein Barr Virus udødeliggjort menneskelig B-lymfocytter og muskelbiopsi avledet satellittceller differensiert i myotubes er beskrevet.
Mer enn 700 varianter i RYR1-genet er identifisert hos pasienter med forskjellige nevromuskulære lidelser, inkludert ondartet hypertermi mottakelighet, kjernemyopatier og centronuclear myopati. På grunn av de forskjellige fenotypene knyttet til RYR1-mutasjoner er det grunnleggende å karakterisere deres funksjonelle effekter for å klassifisere varianter som bæres av pasienter for fremtidige terapeutiske inngrep og identifisere ikke-patogene varianter. Mange laboratorier har vært interessert i å utvikle metoder for å funksjonelt karakterisere RYR1-mutasjoner uttrykt i pasientens celler. Denne tilnærmingen har mange fordeler, inkludert: mutasjoner uttrykkes endogært, RyR1 er ikke over-uttrykt, bruk av heterologe RyR1 uttrykkende celler unngås. Men siden pasienter kan presentere mutasjoner i forskjellige gener til side RYR1, er det viktig å sammenligne resultater fra biologisk materiale fra individer som har samme mutasjon, med forskjellig genetisk bakgrunn. Det nåværende manuskriptet beskriver metoder utviklet for å studere de funksjonelle effektene av endogene uttrykte RYR1-varianter i: (a) Epstein Barr-virus udødeliggjorte humane B-lymfocytter og (b) satellittceller avledet fra muskelbiopsier og differensiert i myotubes. Endringer i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen utløst av tilsetning av en farmakologisk RyR1-aktivatorer overvåkes deretter. Den valgte celletypen er lastet med en forholdsmetrisk fluorescerende kalsiumindikator og intracellulære [Ca2+] endringer overvåkes enten på enkeltcellenivå ved fluorescensmikroskopi eller i cellepopulasjoner ved hjelp av et spektrofluorometer. Hvilen [Ca2+], agonistiske doseresponskurver sammenlignes deretter mellom celler fra sunne kontroller og pasienter som har RYR1-varianter som fører til innsikt i den funksjonelle effekten av en gitt variant.
Til dags dato har mer enn 700 RYR1-varianter blitt identifisert i den menneskelige befolkningen og knyttet til ulike nevromuskulære lidelser, inkludert ondartet hypertermi mottakelighet (MHS), treningsindusert rabdomyolyse, sentral kjernesykdom (CCD), multi-minicore sykdom (MmD), centronuclear myopati (CNM)1,2,3 ; Likevel henger studier for å karakterisere deres funksjonelle effekter, og bare ca. 10% av mutasjonene har blitt testet funksjonelt. Ulike eksperimentelle tilnærminger kan brukes til å vurdere virkningen av en gitt RyR1-variant, inkludert transfeksjon av heterologiske celler som HEK293 og COS-7 celler med plasmid koding for WT og mutant RYR1 cDNA4,5, transduksjon av dyspediske musfibroblaster med plasmider og vektorer koding for WT og mutant RYR1 cDNA, etterfulgt av transduksjon med myo-D og differensiering i myotubes6 , generasjon av transgene dyremodeller som bærer mutant RyR1s7,8,9, karakterisering av celler fra pasienter som uttrykker RYR1-varianten endogent10,11,12. Slike metoder har bidratt til å fastslå hvordan forskjellige mutasjoner funksjonelt påvirker RyR1 Ca2+ kanalen.
Her beskrives metoder utviklet for å vurdere funksjonelle effekter av RYR1 mutasjoner. Ulike parametere av intracellulær kalsium homeostase undersøkes i humane celler endogent uttrykker RyR1 kalsiumkanal, inkludert myotubes og Epstein Barr Virus (EBV) udødeliggjort B-lymfocytter. Celler er hentet fra pasienter, utvidet i kultur og lastet med rasjonmetrisk fluorescerende kalsiumindiktorer som Fura-2 eller indo-1. Parametere som har blitt rapportert å bli endret på grunn av patogene RYR1-mutasjoner, inkludert hvile [Ca2+], følsomheten til forskjellige farmakologiske agonister og størrelsen på de intracellulære Ca2 + -butikkene måles enten på enkeltcellenivå, ved hjelp av fluorescensmikroskopi eller i cellepopulasjoner ved hjelp av et fluorimeter. Resultater oppnådd i celler fra mutasjonsbærere sammenlignes deretter med de som er oppnådd fra friske kontrollfamiliemedlemmer. Denne tilnærmingen har vist at: (i) mange mutasjoner knyttet til MHS fører til en økning i hvilen [Ca2+] og et skifte til venstre i doseresponskurven til enten KCl-indusert depolarisering eller farmakologisk RyR1-aktivering med 4-kloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) mutasjoner knyttet til CCD fører til en reduksjon i toppen [Ca2 +] utgitt ved farmakologisk aktivering av RyR1 og redusert størrelse hvis den intracellulære Ca2 + lagrer12,13,14,15; (iii) noen varianter påvirker ikke Ca2+ homeostase13. Fordelene med denne eksperimentelle tilnærmingen er: RyR1-proteinet er ikke over-uttrykt og fysiologiske nivåer er til stede, celler kan udødeliggjøres (både muskelceller og B-lymfocytter) som gir cellelinjer som inneholder mutasjoner. Noen ulemper er knyttet til det faktum at pasienter kan bære mutasjoner i mer enn ett genkodingsproteiner involvert i kalsium homeostase og / eller eksitasjonskontraksjonskobling (ECC), og dette kan komplisere eksperimentelle konklusjoner. For eksempel ble to JP-45-varianter identifisert i MHS og kontrollpopulasjonen, og deres tilstedeværelse ble vist å påvirke følsomheten til dihydropyridinreseptoren (DHPR) til aktivering16. Pasienter må være tilgjengelige, biologisk materiale må samles inn på nytt og etiske tillatelser må innhentes fra de lokale etiske styrene.
Protokollene beskrevet i denne artikkelen har blitt brukt av flere laboratorier for å studere effekten av RYR1 mutasjoner på kalsium homeostase. De kritiske trinnene i tilnærmingene som er skissert i dette dokumentet, omhandler sterilitet, cellekulturferdigheter og teknikker og tilgjengelighet av biologisk materiale. I prinsippet er bruken av EBV-udødelige B-lymfocytter enklere og gjør det mulig å generere cellelinjer som inneholder mutante RyR1-kanaler. Cellene kan fryses og lagres i flytende nitrogen i mange år,…
The authors have nothing to disclose.
Verket som er beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av tilskudd fra Swiss National Science Foundation (SNF) og Swiss Muscle Foundation.
4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
caffeine | Merk | 102584 | |
Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DMSO | Sigma | 41639 | |
EGTA | Fluka | 3778 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Lanthanum | Fluka | 61490 | |
Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |