Generering af inducerede pluripotente stamceller fra Turner Syndrom (45XO) Fosterceller til downstream modellering af neurologiske underskud forbundet med syndromet

Summary

Denne protokol beskriver generering af integrationsfrie iPSC’er fra føtal væv fibroblaster gennem levering af episomal plasmid ved nucleofection efterfulgt af beskrivelse af metoder, der anvendes til iPSC-karakterisering og neuronal differentiering.

Abstract

Kromosom aneuploidies forårsage alvorlige medfødte misdannelser, herunder centralnervesystemet misdannelser og fosterdød. Prænatal genetisk screening er rent diagnostisk og belyser ikke sygdomsmekanisme. Selv om celler fra aneuploid fostre er værdifulde biologiske materiale, der bærer kromosom aneuploidi, disse celler er kortvarige, begrænser deres anvendelse til downstream forskningsforsøg. Generering af inducerede pluripotente stamcelle (iPSC) modeller er en effektiv metode til celleforberedelse til evig bevarelse af aneuploid træk. De er selvfornyende og differentierer sig i specialiserede celler, der minder om embryonal udvikling. Således tjener iPSC’er som fremragende værktøjer til at studere tidlige udviklingshændelser. Turner syndrom (TS) er en sjælden tilstand forbundet med en helt eller delvist mangler X kromosom. Syndromet er karakteriseret ved infertilitet, kort statur, endokrine, metaboliske, autoimmune og kardiovaskulære lidelser og neurokognitive defekter. Følgende protokol beskriver isolering og dyrkning af fibroblaster fra TS (45XO) fostervæv, generering af integrationsfrie TSIPSCs gennem levering af episomal omprogrammering plasmider ved nucleofection efterfulgt af karakterisering. Den omprogrammering TSIPSCs blev oprindeligt screenet af levende celle alkaliske fosfatase farvning efterfulgt af omfattende sondering for pluripotency biomarkører. Udvalgte kolonier blev mekanisk dissekeret, passager flere gange og stabile selvfornyende celler blev brugt til yderligere eksperimenter. Cellerne udtrykte pluripotency transskription faktorer OCT4, NANOG, SOX2, celle overflade markører SSEA 4 og TRA1-81 typisk for pluripotente stamceller. Den oprindelige 45XO karyotype blev bevaret efter omprogrammering. TSIPSC’erne var i stand til at danne embryonale organer og differentiere sig til celler af endoderm, mesoderm og ectoderm udtrykke afstamning specifikke biomarkører ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De udefrakommende episomale plasmider gik tabt spontant og blev ikke opdaget efter passage 15 i celler. Disse TSIPSCs er en værdifuld cellulær ressource til modellering defekt molekylær og cellulær neuroudvikling forårsager neurokognitive underskud forbundet med Turner syndrom.

Introduction

Aneuploidies føre til fødselsdefekter / medfødte misdannelser og graviditet tab hos mennesker. ~ 50%-70% af prøverne fra graviditet tab viser cytogenetiske abnormiteter. Aneuploid embryoner tabt tidligt i graviditeten kan ikke let opnås til eksperimentel analyse øge behovet for at udvikle andre modeller, der nøje repræsenterer human embryogenese. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) fra celler diagnosticeret med genetiske sygdomme er blevet anvendt til at modellere de repræsentative genetiske uregelmæssigheder og deres konsekvenser for fostrets udvikling^1,2,3,4. Disse iPSC’er ligner epiblastceller i det udviklende embryo og kan generobre de tidlige begivenheder af embryodannelse. De tillader forståelse og karakterisering af udviklingsprogrammet af celle slægter og mønstre i tidlige pattedyr embryoner. iPSC’er, der tidligere stammede fra hudfibroblaster og fostervand fra prænatale diagnostiske tests af aneuploidy syndromer som monosomi X (Turner syndrom), trisomi 8 (Warkany syndrom 2), trisomi 13 (Patau syndrom) og delvis trisomi 11; 22 (Emanuel syndrom) har givet værdifuld indsigt i fejlslagen udvikling⁴.

Turner syndrom (TS) er en sjælden tilstand karakteriseret ved kvindelig infertilitet, kort statur, endokrine og metaboliske lidelser, en øget risiko for autoimmun sygdom og en disposition for hjerte-kar-sygdom⁵. Selv om det er den eneste overlevende monosomi syndrom er det også dødeligt for den udviklende embryo forårsager spontane aborter⁶. Overlevende individer med TS til stede med grader af ændring af X-kromosommateriale i deres celler. Karyotyper spænder fra fuldstændigt tab af et X-kromosom (45,XO) til mosaikker som 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, tilstedeværelsen af ringkromosomer, tilstedeværelsen af Y-kromosommateriale, etc⁵.

Diagnose af syndromet er generelt gjort ved karyotyping blod symptomatiske individer og chorionic villi prøveudtagning (CVS) til at opdage tidlige aneuploidy syndromer. Da aneuploidy syndromer tegner sig for ~ 30% af spontane aborter, er det rutine at karyotype produktet af undfangelse (POC) på en spontan abort. Disse fosterceller, herunder chorionic villi besidder cytogenetiske abnormitet og iPSCs stammer fra dem giver en værdifuld kilde til biologisk materiale til at studere aneuploidy syndromer^4,6. TS iPSCs er tidligere blevet etableret fra fostervande via retroviral omprogrammering⁴, fibroblaster af chorionic villi (opnået gennem prænatal diagnose) via retroviral omprogrammering⁶, fra blod mononuklear celler⁷ via Sendai virus omprogrammering og fra huden fibroblaster af TS individer via lentiviral omprogrammering⁴ . Da det primære fokus for vores laboratorium er at forstå udviklingssvigt, har vi genereret TS iPSCs fra POC, specielt den chorionic villi komponent i en spontan abort⁸. Alle celler isoleret fra dette fostervæv havde en 45XO karyotype og gav iPSCs med samme karyotype. Disse iPSCs er unikke, da de er de første til at blive genereret fra en aborteret foster og give en værdifuld ressource til at studere aneuploidy relaterede graviditet fiaskoer. Denne artikel indeholder en detaljeret metode til generering af iPSCs fra denne unikke cellekilde via episomal omprogrammering.

De tidlige metoder til iPSC-generation brugte viral transduktion og transposoner til at levere omprogrammeringsfaktorerne. Metoder til at inducere celler til pluripotency har udviklet sig fra at bruge integration af retrovirale vektorer⁹, excisable lentiviral vektorer^10,11 og transposon-baserede metoder¹² til ikke-integrere adenoviral vektorer¹³ og Sendai virus baseret vektorer¹⁴. Retroviral og lentiviral baseret omprogrammering, selv om den er effektiv, indebærer integration af omprogrammeringsfaktorerne i værtskromosomerne, hvilket forårsager indsættelsesmutationer, der har uforudsete virkninger i iPSC’erne. Desuden forhindrer viral omprogrammering translationel anvendelse af iPSC’er. RNA-baserede systemer¹⁵ og direkte proteinlevering¹⁶ er blevet undersøgt for helt at eliminere de potentielle risici forbundet med brugen af vira og DNA-transinfektioner. Disse metoder har imidlertid vist sig at være ineffektive.

I 2011 rapporterede Okita et al. forbedret effektivitet af omprogrammering ved episomal plasmid forstærket med TP53 undertrykkelse via shRNA. De erstattede også cMYC med ikke-transformerende LMYC (småcellet lungekarcinom forbundet MYC) for at øge sikkerheden af hiPSCs. Disse episomale plasmider udtrykker 5 omprogrammeringsfaktorer: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC og shRNA for TP53^17,18. Disse vektorer opretholdes ekstrakromosomt og går tabt fra de omprogrammerede celler på kontinuerlig kultur, hvilket gør linjerne transgenefri inden for 10-15 passager. Nucleofection er en specialiseret form for elektroporation, der leverer nukleinsyrer direkte ind i kernen af værtsceller. Det er en effektiv metode til levering af omprogrammering plasmider i forskellige celletyper. Episomal plasmid er omkostningseffektive og kompenserer for de høje omkostninger ved nucleofection. Denne metode er effektiv og reproducerbar under optimerede forhold, der giver stabile iPSCs fra en række somatiske celler. I denne protokol beskriver vi metoden til generering af iPSCs fra fibroblaster isoleret fra fostervæv ved nucleofection af episomal omprogrammering plasmider. Her er de detaljerede protokoller for fibroblast isolation fra føtal chorionic villi, plasmid rensning, nucleofection, picking af kolonier fra omprogrammering plade og etablering af stabile iPSCs.

Det er vigtigt at bekræfte tilstedeværelsen af pluripotency træk i de nygenererede iPSCs. Dette omfatter demonstration af pluripotency relaterede faktorer (f.eks alkaliske fosfatase udtryk, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin, normalt vist med immunofluorescence eller genekspression assays), identifikation af de tre kimlag ved in vitro differentiering assays til at validere deres differentiering potentialer, karyotyping at bestemme kromosomt indhold, STR skrive for at etablere identitet med moderceller, kontrollere tab af udefrakommende gener, og strengere in vivo-analyser såsom teratomadannelse og tetraploid komplementering. Her beskriver vi karakterisering protokoller af karyotyping, levende celler alkaliske fosfatase farvning, påvisning af pluripotency relaterede biomarkører ved immunofluorescence, in vitro differentiering assays og metode til at påvise tab af udefrakommende gener¹⁹.

Protocol

FCV blev opnået fra Manipal Hospital, Bengaluru, under etisk komité for Manipal Hospitaler godkendelse. BEMÆRK: Se tabel 1 for sammensætning af alle buffere og løsninger. 1. Isolering af fibroblaster fra føtal chorionic villi (FCV) Prøveindsamling og vævsopløsning i kollagen Saml FCV under sterile forhold i fosfatbufferet saltvand (PBS) og transport (ved stuetemperatur) til cellekultura…

Representative Results

Generering af integrationsfrie iPSC’er fra et spontant aborteret foster med 45XO karyotypeVi isolerede fibroblaster fra FCV med et Turner syndrom (TS) specifikke 45XO karyotype og nucleofected dem med episomal omprogrammering plasmider til at generere TSIPSCs, som kan bruges til downstream modellering af syndromet, specielt de tilknyttede neurologiske underskud (Figur 1a&b). Vi brugte ikkeintegrerende episomale vektorer og nucleofection til transfection …

Discussion

Generering af stabile cellulære modeller af cyto genetisk unormalt fostervæv er nødvendig for at forevige defekt fænotype. IPSC-ruten er den mest effektive metode til celleforberedelse til evig bevarelse af defekte egenskaber²⁰.

Pluripotente stamceller (PSC) viser egenskaber af selvfornyelse og differentiering i specialiserede celler, der minder om tidlige kavalergangsembryoner²¹. Derfor kan PSC’er tjene som fremragende modeller til at studer…

Materials

0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	–	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays