터너 증후군에서 유도 다능줄기 세포의 생성 (45XO) 증후군과 관련된 신경 적자의 다운 스트림 모델링을위한 태아 세포
Summary
이 프로토콜은 iPSC 특성화 및 신경 분화에 사용되는 방법에 대한 설명에 이어 핵에 의한 상피 플라스미드의 전달을 통해 태아 조직 섬유아세포로부터의 통합 무료 iPSC의 생성을 설명합니다.
Abstract
염색체 부추는 중추 신경계 기형 과 태아 죽음을 포함하여 가혹한 선천적인 기형을 일으키는 원인이 됩니다. 산전 유전자 검사는 순전히 진단이며 질병 메커니즘을 해명하지 않습니다. 무분유 태아의 세포는 염색체 골수 부추를 베어링 귀중한 생물학적 물질이지만, 이러한 세포는 단명하여 다운스트림 연구 실험에 대한 사용을 제한합니다. 유도된 다능성 줄기세포(iPSC) 모델의 생성은 무분비 특성의 영구보존을 위한 세포 제제의 효과적인 방법이다. 그(것)들은 배아 발달을 연상시키는 전문화한 세포로 자기 갱신하고 분화합니다. 따라서 iPSC는 초기 발달 이벤트를 연구할 수 있는 훌륭한 도구역할을 합니다. 터너 증후군 (TS)은 완전히 또는 부분적으로 누락 된 X 염색체와 관련된 드문 상태입니다. 증후군은 불모, 짧은 키, 내분비, 신진 대사, 자가 면역 및 심장 혈관 무질서 및 신경 인지 결함에 의해 특징입니다. 다음 프로토콜은 TS (45XO) 태아 조직에서 섬유 아세포의 격리 및 배양, 핵에 의한 상피 리프로그래밍 플라스미드의 전달을 통한 통합 무료 TSiPSC의 생성을 설명하고 특성화에 따른다. TSiPSCs를 다시 프로그래밍하는 것은 처음에 살아있는 세포 알칼리성 인산염 염색에 의해 검열되었고, 그 다음에 는 자공성 바이오마커에 대한 광범위한 탐구에 의해. 선택된 식민지는 기계적으로 해부되었고, 여러 번 통로를 통과하고 안정적인 자가 갱신 세포가 추가 실험을 위해 사용되었다. 세포발성 전사인 OCT4, NANOG, SOX2, 세포 표면 마커 SSEA 4 및 TRA1-81 전형만능 줄기 세포를 발현하였다. 원래 45XO karyotype은 사후 리프로그래밍을 유지했다. TSiPSCs는 배아 체를 형성하고 계보 특정 바이오마커((SRY BOX17), (MYOSIN 심실 헤비 차이네브/β), (βIII TUBULIN)를 발현하는 엔도름, 중구 및 이포더름의 세포로 분화할 수 있었다. 외인성 상피 플라스미드는 자발적으로 손실되었고 세포에서 15번 을 통과한 후에는 검출되지 않았다. 이러한 TSiPSCs는 터너 증후군과 관련 되 었던 신경 인지 적자를 일으키는 결함이 있는 분자 및 세포 신경 개발을 모델링을 위한 귀중 한 세포 자원.
Introduction
Aneuploidies는 출생 결함/ 선천적인 기형 및 인간에 있는 임신 손실로 이끌어 내는. ~50%-70%의 표본이 임신 손실에서 세포유전학적 이상을 나타낸다. 임신 초기에 잃어버린 Aneuploid 태아는 인간 배아 발생을 밀접하게 대표하는 그밖 모형을 개발하는 필요를 올리는 실험 분석을 위해 쉽게 얻을 수 없습니다. 유전질환으로 진단된 세포로부터 유래된 유도만능 줄기세포(iPSC)는 태아발달1,2,3,4에대한 대표적인 유전적 불규칙성 및 그 결과를 모델링하는 데 사용되어 왔다. 이 iPSCs는 발전 태아의 에피블라스트 세포를 닮고 태아 형성의 초기 사건을 회상할 수 있습니다. 그(것)들은 초기 포유류 태아에 있는 세포 혈통 및 패턴화의 발달 프로그램의 이해 그리고 특성화를 허용합니다. iPSCs는 단조로운 X (터너 증후군), 삼중 증후군 2 (워카니 증후군 2), 삼중 술 13 (파타우 증후군) 및 부분 삼각체 11과 같은 aneuploidy 증후군의 산전 진단 테스트에서 이전에 유래 된 피부 섬유아세포 및 아모니오시테; 22 (에마누엘 증후군) 실패 한 개발에 관한 귀중한 통찰력을 제공 했습니다4.
터너 증후군(TS)은 여성 불임, 짧은 키, 내분비 및 대사 장애, 자가 면역 질환의 위험 증가 및 심혈관 질환에 대한 경향을 특징으로 하는 드문질환이다 5. 유일한 생존 단조로운 증후군이지만 자발적인 낙태를 유발하는 발달 배아에 치명적입니다6. TS를 가진 살아남는 개별은 그들의 세포에 있는 X 염색체 물질의 변경의 정도와 함께 존재합니다. Karyotype은 1개의 X 염색체 (45,XO)의 완전한 손실에서 45, XO/46, XX 같이 모자이크에 구역 수색합니다; 45,XO/47,XXX, 링 염색체의 존재, Y 염색체 물질의 존재 등5.
증후군의 진단은 일반적으로 초기 aneuploidy 증후군을 검출하기 위하여 현상 개별 및 chorionic villi 샘플링 (CVS)의 karyotyping 혈액에 의해 행해합니다. aneuploidy 증후군은 자발적인 낙태의 ~30%를 차지하기 때문에, 자발적인 낙태시 개념작용제(POC)의 산물을 karyotype하는 것이 일상적입니다. 이러한 태아 세포는 세포유전학 적 이상을 소유하는 융모성 빌리와 그들로부터 유래된 iPSC는 골수성 증후군4,6을연구하기 위한 생물학적 물질의 귀중한 근원을 제공한다. TS iPSC는 이전에 레트로바이러스 재프로그래밍4,쇄신비리프로그래밍을통해 초리오닉 빌리의 섬유아세포(산전 진단을 통해 획득)를 통해, 혈액 단핵세포7에서 센다이 바이러스 재프로그래밍을 통해, 그리고 렌티바이러스 리프로그래밍을 통해 TS 개인의 피부 섬유아세포로부터4 . 우리 실험실의 주요 초점은 발달 실패를 이해하는 것입니다 때문에, 우리는 POC에서 TS iPSC, 특히 자발적인 낙태8의chorionic villi 구성 요소를 생성했습니다. 이 태아 조직으로부터 분리된 모든 세포는 45XO karyotype을 가지고 있었고 동일한 karyotype을 가진 iPSC를 산출했습니다. 이 iPSC는 중단된 태아에게서 생성되는 첫번째이고 aneuploidy 관련 임신 실패를 공부하기 위하여 귀중한 자원을 제공하기 때문에 독특합니다. 이 문서에서는 episomal 리프로그래밍을 통해 이 고유한 세포 소스에서 iPSC 생성에 대한 자세한 방법론을 제공합니다.
iPSC 생성의 초기 방법은 재프로그래밍 요인을 전달하기 위하여 바이러스성 전달 및 transposons를 이용했습니다. 세포를 자발성으로 유도하는 방법은 레트로바이러스 벡터9,절제가능한 렌티바이러스벡터(10,11) 및 트랜스포손계법(12)을 비통합 아데노바이러스벡터(13) 및 센다이 바이러스 기반벡터(14)를통합하는 것으로 진화하였다. 레트로 바이러스 및 렌즈 바이러스 기반 재프로그래밍, 비록 효율적이지만, 호스트 염색체에 재프로그래밍 요인의 통합을 포함, iPSCs에 예기치 않은 효과가 삽입 돌연변이를 일으키는. 또한 바이러스 기반 리프로그래밍은 iPSC의 번역 적용을 방지합니다. RNA 기반시스템(15) 및 직접 단백질전달(16)은 바이러스 및 DNA 트랜스펙트 사용과 관련된 잠재적 위험을 완전히 제거하기 위해 탐구되었다. 그러나 이러한 방법은 비효율적이는 것으로 입증되었습니다.
2011년, Okita 외.는 shRNA를 통해 TP53 억제로 증강된 상피 플라스미드에 의한 재프로그래밍효율을 향상시켰다. 그(것)들은 또한 hiPSCs의 안전을 강화하기 위하여 비 변환 LMYC (소세포 폐 암 과 관련된 MYC)로 cMYC를 대체했습니다. 이러한 상피 플라스미드는 5개의 리프로그래밍 인자를 표현합니다: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC 및 shRNA 용 TP5317,18. 이러한 벡터는 연속 배양 시 재프로그래밍된 세포로부터 염색체를 유지하고 손실되므로 10-15개의 항로 내에서 선이 변형되지 않습니다. 핵포션은 숙주 세포의 핵으로 직접 핵산을 전달하는 전문화된 형태의 전기기화이다. 다양한 세포 유형으로 플라스미드를 재프로그래밍하는 효율적인 방법입니다. 상피 플라스미드는 비용 효율적이며 핵포페션의 높은 비용을 보상한다. 이 방법은 다양한 체세포에서 안정적인 iPSC를 산출하는 최적화된 조건하에서 효율적이고 재현가능합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 episomal 재프로그래밍 plasmids의 핵에 의해 태아 조직에서 분리된 섬유아세포에서 iPSCs의 생성을 위한 방법을 기술합니다. 여기에 태아 융모 성 빌리에서 섬유 아세포 절연에 대한 상세한 프로토콜입니다, 플라스미드 정제, 핵, 리프로그래밍 플레이트에서 식민지의 따기 및 안정적인 iPSC의 설립.
새로 생성된 iPSC에서 흉부 특성의 존재를 확인하는 것이 필수적입니다. 여기에는 흉부 관련 요인의 데모가 포함됩니다(예: 알칼리성 인산염 발현, 나노G, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; 일반적으로 면역 불피성 또는 유전자 발현 분석으로 표시), 체외 분화 분석에 의한 3개의 세균 층식별, 염색체 함량을 확인하기 위한 카르요티핑, 염색체 의 특징, 특성화, 신장증의 피성, 신장증 의 식별 그리고 테라종 형성 및 테트라클로이드 보완과 같은 생체 내 소세포가 더욱 엄격합니다. 여기서는 카요타이핑, 살아있는 세포 알칼리인포스파아제 염색, 면역형광에 의한 pluripotency 관련 바이오마커의 검출, 외인성 유전자의 손실을 입증하는 체외 분화분석 및 방법을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포유전학적으로 비정상적인 태아 조직의 안정적인 세포 모델의 생성은 결함이 있는 표현형을 영속시키기 위해 필요하다. iPSC 경로는 결함이 있는특성(20)의영구 보존을 위한 세포 제제의 가장 효과적인 방법입니다.
다능성 줄기 세포(PSC)는 초기 분열배아(21)를연상시키는 특수 세포로 자가 재생 및 분화의 특성을 표시한다. 따라서, PSC는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
위의 연구에 대한 재정 지원은 고등 교육의 매니팔 아카데미에 의해 제공되었다. 라인의 특성화는 NCBS에서 M.M. 패닉커의 실험실에서 부분적으로 수행되었다. 우리는 카요타이핑에 대한 도움을 아난드 진단 연구소에 감사드립니다.
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
References
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