Geração de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas da Síndrome de Turner (45XO) Células Fetais para Modelagem A Jusante de Déficits Neurológicos Associados à Síndrome
Summary
Este protocolo descreve a geração de iPSCs livres de integração a partir de fibroblastos de tecido fetal através da entrega de plasmídeos epissomais por nucleofecção seguida pela descrição dos métodos utilizados para caracterização do iPSC e diferenciação neuronal.
Abstract
Aneuploidies cromossômicos causam malformações congênitas graves, incluindo malformações do sistema nervoso central e morte fetal. O rastreamento genético pré-natal é puramente diagnóstico e não elucida mecanismo da doença. Embora as células de fetos aneuploides sejam materiais biológicos valiosos que suportam a aneuploide cromossômica, essas células têm vida curta, limitando seu uso para experimentos de pesquisa a jusante. A geração de modelos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) é um método eficaz de preparação celular para conservação perpétua de traços aneuploides. São auto-renovados e diferenciados em células especializadas que lembram o desenvolvimento embrionário. Assim, os iPSCs servem como excelentes ferramentas para estudar eventos de desenvolvimento precoce. Síndrome de Turner (TS) é uma condição rara associada a um cromossomo X completamente ou parcialmente ausente. A síndrome é caracterizada por infertilidade, baixa estatura, endócrina, metabolica, autoimune e doenças cardiovasculares e defeitos neurocognitivos. O protocolo a seguir descreve o isolamento e a culminação de fibroblastos do tecido fetal TS (45XO), geração de TSiPSCs livres de integração através da entrega de plasmídeos de reprogramação epissomal por nucleosfeitivo seguido de caracterização. Os TSiPSCs de reprogramação foram inicialmente examinados por manchas de fosfatesas alcalinas de células vivas seguidas de sondagem extensiva para biomarcadores de pluripotência. Colônias selecionadas foram dissecadas mecanicamente, passagens várias vezes e células estáveis de auto-renovação foram utilizadas para outros experimentos. As células expressaram fatores de transcrição de pluripotência OCT4, NANOG, SOX2, marcadores de superfície celular SSEA 4 e TRA1-81 típicos de células-tronco pluripotentes. O karyotype 45XO original foi mantido após a reprogramação. Os TSiPSCs foram capazes de formar corpos embrionários e diferenciar-se em células de endoderme, mesoderme e ectoderme expressando biomarcadores específicos de linhagem ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Os plasmídeos episômicos exógenos foram perdidos espontaneamente e não detectados após a passagem 15 nas células. Estes TSiPSCs são um recurso celular valioso para modelar neurodesenvolvimento molecular e celular defeituoso causando déficits neurocognitivos associados à síndrome de Turner.
Introduction
As aneuploidias levam a defeitos congênitos/malformações congênitas e perda de gravidez em humanos. ~50%-70% dos espécimes de perdas de gravidez mostram anormalidades citogenéticas. Embriões aneuploides perdidos no início da gravidez não podem ser facilmente obtidos para análise experimental, levantando a necessidade de desenvolver outros modelos representando de perto a embriogênese humana. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de células diagnosticadas com distúrbios genéticos têm sido utilizadas para modelar as irregularidades genéticas representativas e suas consequências no desenvolvimento fetal1,2,3,4. Estes iPSCs se assemelham a células epiblastos do embrião em desenvolvimento e podem recapitular os primeiros eventos da formação de embriões. Permitem a compreensão e caracterização do programa de desenvolvimento de linhagens celulares e padronização em embriões mamíferos primitivos. iPSCs derivados anteriormente de fibroblastos de pele e amniócitos de testes de diagnóstico pré-natal de síndromes de aneuploidia como monosomia X (síndrome de Turner), trissomia 8 (síndrome warkany 2), trissomia 13 (síndrome de Patau) e trissomia parcial 11; 22 (síndrome de Emanuel) forneceram insights valiosos sobre o desenvolvimento fracassado4.
A síndrome de Turner (TS) é uma condição rara caracterizada pela infertilidade feminina, baixa estatura, distúrbios endócrinos e metabólicos, um risco aumentado de doença autoimune e uma predisposição à doença cardiovascular5. Embora seja a única síndrome de monossomia sobrevivente, também é letal para o embrião em desenvolvimento causando abortos espontâneos6. Indivíduos sobreviventes com TS apresentam graus de alteração de material x-cromossômico em suas células. Os karyótipos variam da perda completa de um cromossomo X (45,XO) a mosaicos como 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, a presença de cromossomos de anel, a presença de material cromossômico Y, etc5.
O diagnóstico da síndrome é geralmente feito por karyotipping sangue de indivíduos sintomáticos e amostragem de villi coriônica (CVS) para detectar síndromes de aneuploidia precoce. Como as síndromes de aneuploidia são responsáveis por ~30% dos abortos espontâneos, é rotina o karyótipo do produto da concepção (POC) após um aborto espontâneo. Essas células fetais, incluindo o villi coriônico que possui a anormalidade citogenética e os iPSCs derivados delas fornecem uma valiosa fonte de material biológico para estudar as síndromes de aneuploide4,6. Os IPSCs de TS foram previamente estabelecidos a partir de amniocitos via reprogramação retroviral4, fibroblastos de villi coriônico (obtidos através de diagnóstico pré-natal) via reprogramação retroviral6, a partir de células mononucleares de sangue7 via reprogramação do vírus Sendai e de fibroblastos de pele de indivíduos TS via reprogramação lentitina4 . Como o foco principal do nosso laboratório é entender a falha no desenvolvimento, geramos iPSCs de TS do POC, especificamente o componente de villi coriônico de um aborto espontâneo8. Todas as células isoladas deste tecido fetal tinham um karyótipo 45XO e produziam iPSCs com o mesmo karyótipo. Esses iPSCs são únicos, pois são os primeiros a serem gerados a partir de um feto abortado e fornecem um recurso valioso para estudar falhas relacionadas à aneuploidey. Este artigo fornece uma metodologia detalhada da geração de iPSCs a partir desta fonte celular única através da reprogramação epissomal.
Os primeiros métodos de geração iPSC utilizaram transdução viral e transposons para entregar os fatores de reprogramação. Os métodos de induzir células à pluripotência evoluíram do uso de vetores retrovirais integradores9, vetores lentiviras excisáveis10,11 e métodos baseados em transposon12 para vetores adenovirais não integradores13 e vetores baseados em vírus Sendai14. A reprogramação baseada em retroviral e lentiviral, embora eficiente, envolve a integração dos fatores de reprogramação nos cromossomos hospedeiros, causando mutações de inserção que têm efeitos imprevistos nos iPSCs. Além disso, a reprogramação baseada em virais impede a aplicação translacional de iPSCs. Os sistemas baseados em RNA15 e a entrega direta deproteínas 16 foram explorados para eliminar completamente os riscos potenciais associados ao uso de vírus e transfecções de DNA. No entanto, esses métodos têm se mostrado ineficientes.
Em 2011, Okita et al. relataram maior eficiência de reprogramação por plasmídeos episômicos aumentados com supressão TP53 via shRNA. Eles também substituíram o cMYC por LMYC não transformador (carcinoma pulmonar de células pequenas associados myc) para aumentar a segurança dos hiPSCs. Estes plasmídeos episômicos expressam 5 fatores de reprogramação: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC e shRNA para TP5317,18. Esses vetores são mantidos extra-cromosomally e perdidos das células reprogramadas sobre a cultura contínua, tornando as linhas livres de transgene dentro de 10-15 passagens. A nucleofecção é uma forma especializada de eletroporação que fornece ácidos nucleicos diretamente no núcleo das células hospedeiras. É um método eficiente para a entrega dos plasmídeos de reprogramação em vários tipos de células. Plasmídeos episômicos são econômicos e compensam os altos custos de nucleosfeição. Este método é eficiente e reprodutível em condições otimizadas, produzindo iPSCs estáveis de uma variedade de células somáticas. Neste protocolo, descrevemos o método de geração de iPSCs a partir de fibroblastos isolados do tecido fetal por nucleofecção de plasmídeos de reprogramação epissomal. Aqui estão os protocolos detalhados para o isolamento do fibroblasto a partir de villi coriônico fetal, purificação plasmida, nucleofecção, colheita de colônias da placa de reprogramação e estabelecimento de iPSCs estáveis.
É essencial confirmar a presença de traços de pluripotência nos iPSCs recém-gerados. Isso inclui a demonstração de fatores relacionados à pluripotência (por exemplo, expressão alcalina fosfatase, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; geralmente mostrado com imunofluorescência ou ensaios de expressão genética), identificação das três camadas de germes por ensaios de diferenciação in vitro para validar seus potenciais de diferenciação, karyotyping para determinar conteúdo cromossômico, digitação STR para estabelecer identidade com células-pais, verificar perda de genes exógenos, e ensaios in vivo mais rigorosos, como formação de teratoma e complementação tetraploide. Aqui descrevemos protocolos de caracterização de kariotipagem, coloração alcalina de fosfatese de células vivas, detecção de biomarcadores relacionados à pluripotência por imunofluorescência, ensaios de diferenciação in vitro e método para demonstrar perda de genes exógenos19.
Protocol
Representative Results
Discussion
A geração de modelos celulares estáveis de tecido fetal citogeneticamente anormal é necessária para perpetuar o fenótipo defeituoso. A rota iPSC é o método mais eficaz de preparação celular para conservação perpétua de propriedades defeituosas20.
Células-tronco pluripotentes (PSC) apresentam propriedades de auto-renovação e diferenciação em células especializadas que lembram os embriões de decote precoce21. Assim, os PSCs pode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio financeiro para a pesquisa acima foi fornecido pela Manipal Academy of Higher Education. A caracterização da linha foi conduzida parcialmente no laboratório de M.M. Panicker na NCBS. Agradecemos ao Laboratório de Diagnóstico anand pela ajuda com o karyotyping.
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
References
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