Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من متلازمة تيرنر (45XO) خلايا الجنين لنمذجة المصب من العجز العصبي المرتبطة متلازمة

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/62240
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول توليد iPSCs خالية من التكامل من الخلايا الليفية أنسجة الجنين من خلال تسليم البلازميدات الظهارية عن طريق النيوكليوفكشن تليها وصف الأساليب المستخدمة لتوصيف iPSC والتمايز العصبي.

Abstract

تسبب التشوهات الصبغية تشوهات خلقية حادة بما في ذلك تشوهات الجهاز العصبي المركزي وموت الجنين. الفحص الوراثي قبل الولادة هو تشخيص محض ولا يوضح آلية المرض. على الرغم من أن الخلايا من الأجنة aneuploid هي مادة بيولوجية قيمة تحمل الأنوبلويدي الكروموسومي، هذه الخلايا قصيرة الأجل، والحد من استخدامها للتجارب البحثية المصب. جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) نماذج هو وسيلة فعالة لإعداد الخلايا للحفاظ الدائم على الصفات aneuploid. فهي تجدد نفسها وتفرق إلى خلايا متخصصة تذكرنا بالتطور الجنيني. وبالتالي، فإن مراكز دعم الدراسة الدولية تعمل كأدوات ممتازة لدراسة الأحداث التنموية المبكرة. متلازمة تيرنر (TS) هي حالة نادرة مرتبطة بكروموسوم X مفقود كليا أو جزئيا. تتميز المتلازمة بالعقم وقصر القامة والغدد الصماء والتمثيل الغذائي والمناعة الذاتية واضطرابات القلب والأوعية الدموية والعيوب العصبية المعرفية. يصف البروتوكول التالي عزل وزراعة الخلايا الليفية من أنسجة الجنين TS (45XO) ، وتوليد TSiPSCs الحرة التكامل من خلال تسليم البلازميدات إعادة برمجة الظهارية عن طريق التصريف النووي يليه التوصيف. تم فحص TSiPSCs إعادة برمجة في البداية عن طريق تلطيخ الفوسفاتاز القلوية الخلية الحية تليها التحقيق واسعة النطاق للمؤشرات الحيوية متعددة الأضلاع. تم تشريح مستعمرات مختارة ميكانيكيا، ومرورها عدة مرات، واستخدمت خلايا مستقرة متجددة ذاتيا لإجراء المزيد من التجارب. وأعربت الخلايا عن عوامل النسخ متعددة الخلايا OCT4، NANOG، SOX2، علامات سطح الخلية SSEA 4 و TRA1-81 نموذجية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. تم الاحتفاظ الأصلي 45XO karyotype إعادة برمجة آخر. وتمكنت هذه المركبات من تشكيل أجسام جنينية وتمييزها إلى خلايا من الاندوديرم والميزوديرم والإيكوديرم تعبر عن علامات بيولوجية محددة النسب ((SRY BOX17)، (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β)، (βIII TUBULIN)). فقدت البلازميدات الظهارية الخارجية تلقائيا ولم يتم اكتشافها بعد مرور 15 في الخلايا. هذه TSiPSCs هي مورد خلوي قيم لنمذجة النمو العصبي الجزيئي والخلوي المعيب مما يسبب عجزا عصبيا معمنا مرتبطا بمتلازمة تيرنر.

Introduction

تؤدي العيوب الخلقية إلى التشوهات الخلقية وفقدان الحمل لدى البشر. ~ 50٪ -70٪ من العينات من فقدان الحمل تظهر تشوهات وراثية. لا يمكن الحصول بسهولة على الأجنة Aneuploid فقدت في وقت مبكر من الحمل للتحليل التجريبي مما يزيد من الحاجة إلى تطوير نماذج أخرى تمثل عن كثب تكوين الأجنة البشرية. وقد استخدمت الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المستمدة من الخلايا التي تم تشخيصها بالاضطرابات الوراثيةلنمذجة المخالفات الوراثية التمثيلية وعواقبها على نمو الجنين1و2و3و4. تشبه هذه iPSCs الخلايا الأرومية للجنين النامي ويمكن أن تلخص الأحداث المبكرة لتكوين الجنين. وهي تسمح بفهم وتوصيف البرنامج التنموي لنساب الخلايا والأنماط في أجنة الثدييات المبكرة. iPSCs المستمدة سابقا من الخلايا الليفية الجلدية وخلايا الأمني من الاختبارات التشخيصية قبل الولادة من متلازمات أنوبلوبيدي مثل أحادي الصبغة X (متلازمة تيرنر), التثلث الصبغي 8 (متلازمة واركاني 2), التثلث الصبغي 13 (متلازمة باتو) والتثلث الصبغي الجزئي 11; 22 (متلازمة إيمانويل) قدمت رؤى قيمة بشأن فشل التنمية4.

متلازمة تيرنر (TS) هي حالة نادرة تتميز بعقم الإناث ، وقصر القامة ، واضطرابات الغدد الصماء والتمثيل الغذائي ، وزيادة خطر الإصابة بأمراض المناعة الذاتية ، والاستعداد لأمراض القلب والأوعية الدموية5. على الرغم من أنها متلازمة أحادية الصدر الوحيدة التي يمكن البقاء عليها ، إلا أنها قاتلة أيضا للجنين النامي الذي يسبب الإجهاض التلقائي6. الأفراد الباقين على قيد الحياة مع TS الحاضر مع درجات من تغيير المواد الكروموسومية X في خلاياهم. Karyotypes تتراوح بين فقدان كامل كروموسوم X واحد (45،XO) إلى الفسيفساء مثل 45،XO/46،XX؛ 45، XO/47، XXX، وجود الكروموسومات حلقة، وجود المواد الكروموسومات Y، الخ5.

يتم تشخيص المتلازمة بشكل عام عن طريق كتابة الدم من الأفراد الذين يعانون من أعراض وأخذ عينات من الزغب المشيمي (CVS) للكشف عن متلازمات الإصابة المبكرة. منذ المتلازمات aneuploidy تمثل ~ 30 ٪ من عمليات الإجهاض التلقائي ، فمن الروتيني لkaryotype نتاج الحمل (POC) عند الإجهاض التلقائي. هذه الخلايا الجنينية بما في ذلك الزغب المشيمي امتلاك الشذوذ الجيني الخلوي و iPSCs المستمدة منها توفر مصدرا قيما للمواد البيولوجية لدراسة متلازمات أنوبلويدي4،6. وقد أنشئت سابقا TS iPSCs من amniocytes عن طريق إعادة برمجةالفيروسات الرجعية 4, الخلايا الليفية من الزغب المشيمي (التي تم الحصول عليها من خلال التشخيص قبل الولادة) عن طريق إعادة برمجة الفيروساتالرجعية 6, من خلايا الدم أحادية النووية 7 عن طريقإعادة برمجة فيروس سينداي ومن الخلايا الليفية الجلدية من الأفراد TS عن طريق إعادة برمجةالعدسية 4 . منذ التركيز الأساسي من مختبرنا هو فهم فشل النمو, لقد ولدت TS iPSCs من POC, على وجه التحديد مكون الزغب chorionic من الإجهاض العفوي8. جميع الخلايا المعزولة من هذا النسيج الجنيني كان لها 45XO karyotype وأسفرت عن iPSCs مع نفس karyotype. هذه iPSCs هي فريدة من نوعها لأنها أول من يتم إنشاؤها من الجنين المجهض وتوفير مورد قيمة لدراسة فشل الحمل المرتبطة aneuploidy. توفر هذه المقالة منهجية مفصلة من جيل iPSCs من هذا المصدر الفريد للخلايا عن طريق إعادة برمجة الظهارية.

استخدمت الطرق المبكرة لجيل iPSC النقل الفيروسي والاستقبالات لتقديم عوامل إعادة البرمجة. وقد تطورت أساليب حث الخلايا على متعددة الأضلاع من استخدام دمج ناقلات الفيروساتالرجعية 9، ناقلات العدسية القابلة للستئصال10،11 والأساليب القائمة على الإرسال والاستقبال12 إلى ناقلات أدينوفيرالية غير متكاملة13 وناقلات فيروس سينداي القائمةعلى 14. إعادة البرمجة القائمة على الفيروسات الرجعية والبرومبرم، على الرغم من كفاءتها، تنطوي على دمج عوامل إعادة البرمجة في الكروموسومات المضيفة، مما تسبب في طفرات الإدراج التي لها آثار غير متوقعة في iPSCs. وعلاوة على ذلك، تمنع إعادة البرمجة الفيروسية التطبيق الترجمي ل iPSCs. وقد تم استكشاف النظم القائمة على الحمض النووي الريبي15 وتسليم البروتين المباشر16 للقضاء تماما على المخاطر المحتملة المرتبطة باستخدام الفيروسات وأجهزة نقل الحمض النووي. ومع ذلك، أثبتت هذه الطرق عدم كفاءتها.

وفي عام 2011، أفادت أوكيتا وآخرون عن تحسن كفاءة إعادة البرمجة بواسطة البلازميدات الظهارية المعززة بقمع TP53 عن طريق الشرنا. كما أنها استبدلت cMYC مع LMYC غير تحويل (سرطان الرئة الخلية الصغيرة المرتبطة MYC) لتعزيز سلامة hiPSCs. هذه البلازميدات الظهارية تعبر عن 5 عوامل إعادة برمجة: OCT4، LIN28، SOX2، KLF4، LMYC وshRNA ل TP5317،18. يتم الحفاظ على هذه النواقل خارج كروموسوميا وفقدت من الخلايا المبرمجة على الثقافة المستمرة، مما يجعل خطوط متحولة خالية من خلال 10-15 مقاطع. النيوكليوفينكشن هو شكل متخصص من الكهرومporation الذي يسلم الأحماض النووية مباشرة إلى نواة الخلايا المضيفة. وهي طريقة فعالة لتسليم البلازميدات إعادة برمجة في أنواع مختلفة من الخلايا. البلازميدات الظهارية فعالة من حيث التكلفة وتعويض التكاليف العالية للنواة. هذه الطريقة فعالة وقابلة للاستنساخ في ظل ظروف محسنة تسفر عن iPSCs مستقرة من مجموعة متنوعة من الخلايا الجسدية. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طريقة لتوليد iPSCs من الخلايا الليفية معزولة عن أنسجة الجنين عن طريق النوى من البلازميدات إعادة برمجة الظهارية. فيما يلي البروتوكولات التفصيلية لعزل الخلايا الليفية من الزغب المشيمي الجنيني ، وتنقية البلازميد ، والتكسير النووي ، واختيار المستعمرات من لوحة إعادة البرمجة وإنشاء iPSCs مستقرة.

من الضروري تأكيد وجود سمات متعددة الخصائص في iPSCs التي تم إنشاؤها حديثا. ويشمل ذلك بيان العوامل المتعددة العوامل المتصلة (على سبيل المثال، التعبير الفوسفاتاز القلوية، NANOG، SSEA4، ترا 1-80، ترا 1-81، E-cadherin؛ يظهر عادة مع المناعة أو المقايسات التعبير الجيني)، وتحديد الطبقات الجرثومية الثلاث من خلال المقايسات التمايز في المختبر للتحقق من إمكانات التفريق، karyotyping لتحديد المحتوى الكروموسومي، STR الكتابة لتحديد الهوية مع الخلايا الأم، والتحقق من فقدان الجينات الخارجية، وأكثر صرامة في المقايسات فيفو مثل تشكيل المسخ وتكميل رباعي الأرجل. هنا نحن نصف بروتوكولات توصيف karyotyping، الخلايا الحية الفوسفاتاز القلوية تلطيخ، والكشف عن المؤشرات الحيوية متعددة الخلايا ذات الصلة عن طريق immunofluorescence، في المختبر التمايز المقايسات وطريقة لإثبات فقدان الجينات الخارجية19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على FCV من مستشفى مانيبال، بنغالورو، بموجب موافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفيات مانيبال.

ملاحظة: راجع الجدول 1 لتكوين كافة المخازن المؤقتة والحلول.

1. عزل الخلايا الليفية من الزغب المشيمي الجنيني (FCV)

  1. جمع العينات وتفكك الأنسجة في الكولاجيناز
    1. جمع FCV في ظل ظروف معقمة في الفوسفات العازلة المالحة (PBS) والنقل (في درجة حرارة الغرفة) إلى مرفق ثقافة الخلية.
    2. نقل الزغب إلى طبق بيتري 60 ملم وغسل عدة مرات (الحد الأدنى 4 مرات) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1x المضادة للمضادات الحيوية المضادة للذهان حل (PBS-AA). إزالة PBS-AA تماما عن طريق pipetting.
    3. علاج الزغب المشيمي مع مزيج كولاجيناز 1 مل (5 ملغم / مل) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
    4. تحييد مع خلية الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين (FBS)، نقل هضم إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 225 × ز لمدة 5 دقائق لجمع الزغب تفككت والخلايا الصادرة كبيليه.
  2. الثقافة الفرعية وتوسيع المخزون
    1. لوحة سيلي تفككت جنبا إلى جنب مع الخلايا الصادرة في قارورة ثقافة T25 تحتوي على 5 مل من وسائل الإعلام كاملة (على سبيل المثال، AmnioMAX) وتنمو حتى يتم الحصول على ثقافة الخلايا الليفية التقاء.
    2. توسيع الخلايا الليفية في الثقافة لإعداد المخزونات لاستخدامها في تجارب العدوى والتوصيف اللاحقة على النحو التالي:
      1. إضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين إلى قارورة T25 التي تحتوي على الخلايا الليفية FCV واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق لتفكيك الخلايا.
      2. بعد الحضانة، تحييد التريبسين بإضافة FBS (بنفس حجم التريبسين).
        ملاحظة: يمكن أيضا استخدام وسيط الثقافة الذي يحتوي على FBS لتحييد التريبسين، عند إضافته عند 1:3 تريبسين: نسبة الوسائط.
      3. جمع الخلايا المفككة في أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 225 × ز لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية.
      4. Decant supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من وسائل الإعلام كاملة.
      5. نقل 500 ميكرولتر لكل إلى 60 ملم الأنسجة الأطباق المعالجة بزراعة تشكل حجم إلى 5 مل. هذه النسبة تقسيم 1:2، كما استخدمت للممرات اللاحقة.
  3. التبريد
    1. إجراء الانزيمية الانفصال باستخدام 0.05٪ تريبسين كما هو موضح في الخطوات 1.2.2.1 - 1.2.2.3 والحصول على بيليه الخلية.
    2. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من مزيج التجميد، التي تتألف من 1:9 ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO): FBS.
    3. نقل محتويات إلى cryovial معقمة ووضع القارورة في حاوية التجميد.
    4. تجميد بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية ومن ثم نقل قوارير إلى النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) في اليوم التالي.

2. Plasmids عزل الحمض النووي والتحقق

  1. إعداد الخلايا البكتيرية
    1. الأسهم الجلسرين المتتالية من الإشريكية القولونية التي تحتوي على ثلاثة بلازميدات فردية pCXLE-hOCT3/4-shp53-F، pCXLE-hSK و pCXLE-hUL (من أدجين) على لوحات لوريا بيرتاني-أمبيسلين أجار منفصلة.
    2. تلقيح مستعمرات واحدة في الثقافات بداية من 5 مل من لوريا بيرتاني-ampicillin المتوسطة. حضانة لمدة 8 ساعات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز (10 × ز).
    3. تلقيح 200 ميكرولتر من هذه الثقافة بداية في 100 مل من لوريا بيرتاني أمبيسلين المتوسطة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
    4. حصاد بين عشية وضحاها الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 6000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  2. عزلة البلازميد مع مجموعة تنقية ميدي بلازميد
    1. Resuspend الكريات البكتيرية في 4 مل احتياطي إعادة الإنفاق.
    2. إضافة 4 مل من العازلة تحلل وتخلط جيدا عن طريق عكس بقوة 4-6 مرات واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. أضف 4 مل من عازلة تحييد المبردة مسبقا وانبوب مقلوب 4-6 مرات لخلط جيدا. احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    4. جهاز طرد مركزي عند 20,000 ≥ × غرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جمع supernatant في أنبوب جديد وإعادة الطرد المركزي في ≥20،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    5. قم بتكميل العمود بتطبيق 4 مل من المخزن المؤقت للتوازن.
    6. تطبيق supernatant إلى العمود.
    7. اغسل العمود مرتين مع 10 مل من مخزن الغسيل المؤقت.
    8. الحمض النووي Elute مع 5 مل من الحارة (65 درجة مئوية) العازلة elution.
    9. تسريع الحمض النووي بإضافة 3.5 مل من الأيزوبروبانول إلى الحمض النووي الملوت. تخلط جيدا. جهاز طرد مركزي عند 15,000 ≥ × غرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. (ديكانت) فائق الطبيعة بعناية.
    10. غسل بيليه الحمض النووي مع 2 مل من الإيثانول 70٪ والطرد المركزي في ≥15،000 × ز لمدة 10 دقيقة. (ديكانت) فائق الطبيعة بعناية.
    11. الكريات الجافة الهواء لمدة 5-10 دقيقة وتذوب الحمض النووي في حجم مناسب من الماء PCR الصف للحصول على تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: لا تذوب الحمض النووي في المخازن المؤقتة لأنه غير مناسب للكهرومporation. إعداد الحمض النووي القديم البلازميد لا تسفر عن مستعمرات مبرمجة.
  3. التحقق من البلازميد بواسطة EcoRI تقييد الهضم
    1. الجمع بين 15 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز، 2 ميكرولتر من العازلة 10x، 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد و 1 ميكرولتر من إنزيم EcoRI. تخلط بلطف.
    2. احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة الحرارة.
    3. مزيج عينات البلازميد المهضومة مع 6x الحمض النووي هلام تحميل صبغ وe electrophorese على هلام agarose 1٪ في العازلة TAE 1x مع 0.5 ميكروغرام / مل من بروميد الإيثيديوم. تضمين سلم DNA القياسي. صورة الجل بعد أن تم حل الحمض النووي بشكل مناسب. أحجام النطاق EcoRI المتوقعة من pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F هي 6,834 نقطة أساس و 3,758 نقطة أساس و 1,108 نقطة أساس؛ pCXLE-hUL هي 10,200 نقطة أساس و 1,900 نقطة أساس; pCXLE-hSK هي 10,200 نقطة أساس و 2,500 نقطة أساس.

3. النيوكليوفكشن

  1. الكريات الخلية
    1. ثقافة الخلايا الليفية chorionic الجنين المعزول في قارورة T25 في 5 مل من وسائل الإعلام الكاملة حتى التقاء 80-90٪.
    2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وتريبسينيز كما هو موضح في الخطوات 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. إزالة الكريات العملاقة، ريسوسبند في 5 مل من وسائل الإعلام المصل مخفضة (على سبيل المثال، Opti-MEM). عد الخلايا مع مقياس الدم واتخاذ 106 خلايا للنواة. جهاز طرد مركزي عند 225 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة فائقة تماما.
  2. إعداد الكاشف والنوى
    1. إعداد كاشف النوى عن طريق خلط 0.5 مل من الملحق و 2.25 مل من محلول النوى (كلاهما متوفر في المجموعة).
    2. أضف 100 ميكرولتر من محلول النوى في أنبوب 1.5 مل. إضافة 1μg كل من pCXLE-hOCT3/4-shp53-F، pCXLE-hSK وpCXLE-hUL إلى الأنبوب. إعادة إنفاق بلطف 106 خلايا (من الخطوة 3.1.2) في هذا المزيج.
    3. نقل تعليق الخلية الحمض النووي إلى cuvette، وضمان أن العينة تغطي الجزء السفلي من cuvette (المنصوص عليها في عدة) دون أي فقاعات الهواء. قم بوضع غطاء للكوفيت وأدخله في الحامل. حدد برنامج النوى U-23 (لتحقيق كفاءة عالية) وتطبيقه.
    4. إزالة cuvette من حامل وإضافة 1 مل من وسائل الإعلام كاملة. نقل محتويات بلطف إلى 60 ملم زراعة الأنسجة معالجة طبق بيتري مليئة 4 مل من وسائل الإعلام كاملة (إلى ما مجموعه 5 مل من وسائل الإعلام). احتضان الخلايا في حاضنةCO2 مرطبة عند 37 درجة مئوية.
    5. بعد 24 ساعة، تحقق مما إذا كانت الخلايا قد تعلق. استبدال المتوسطة تماما.
      ملاحظة: معدل موت الخلايا مرتفع في النيوكليوفكشن مما يترك القليل من الخلايا القابلة للحياة التي تعلق.
    6. الحفاظ على الخلايا في وسائط كاملة لمدة 10 أيام والتحول إلى وسائل الإعلام متعددة الخلايا لمدة 20 يوما القادمة.
      ملاحظة: تصور الخلايا بانتظام لمتابعة التغيرات المورفولوجية التي تحدث في خلايا إعادة البرمجة (مثل مورفولوجيا الظهارية وتشكيل المستعمرة المدمجة) لتأكيد ما إذا كانت التجربة تعمل. يمكن رؤية حوالي 25 مستعمرة iPSC بعد 20 يوما من الثقافة في وسائل الإعلام المتعددة.

4. انتقاء وانتشار مستعمرات iPSC

  1. اختيار مستعمرة من لوحة إعادة البرمجة
    1. تشريح يدويا المستعمرات الجنينية مثل الخلايا الجذعية التي تشكلت في طبق إعادة البرمجة باستخدام ماصة الزجاج سحبت أو إبر حقنة 1 مل ونقلها إلى لوحة أعدت سابقا مع مغذيات الماوس الجنينية المعطلة مع المتوسطة متعددة الخلايا أو إنشاء الثقافات الحرة المغذية على لوحات المغلفة Matrigel مع المتوسط mTESR.
      ملاحظة: تم اشتقاق الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) باستخدام العزل الأنزيمي من أجنة الفئران (تشريح من الفئران الإناث الحوامل 13-14 يوما) وتم تعطيل mitotically عن طريق العلاج mitomycin C. إنشاء مجموعات استنساخ واحدة عن طريق زراعة مستعمرات واحدة من لوحة إعادة البرمجة في أطباق منفصلة أو مجموعات مستنسخة مختلطة عن طريق نقل العديد من المستعمرات من لوحة إعادة البرمجة إلى طبق واحد.
  2. النقل الميكانيكي للمستعمرات الناشئة إلى مغذيات طازجة والمرور لإنشاء iPSCs مستقرة
    1. نشر iPSCs في المتوسط متعددة عن طريق التغذية كل يوم الثاني وتقسيم 1:3 كل 5-7 أيام. إعداد المخزونات عن طريق حفظ التبريد في مزيج تجميد استبدال مصل KnockOut وDMSO في نسبة 9:1.
      ملاحظة: يستخدم استبدال مصل KnockOut في مزيج التجميد لحفظ التبريد من iPSCs بدلا من FBS كمكونات في FBS يمكن أن تحفز التفريق بين الخلايا متعددة القدرات أثناء الحفظ على المدى الطويل.

5. توصيف iPSCs

ملاحظة: أجريت دراسات التوصيف بما في ذلك PCR والتبويب المناعي للعلامات الحيوية متعددة المؤشرات بعد رقم المقطع الخامس. تم تنفيذ كاريوتيبينج في عدد مرور لاحق.

  1. كاريوتيبينج
    1. علاج طبق بيتري التقاء 60 ملم من iPSCs مع colcemid لمدة 45 دقيقة في حاضنة CO2 الرطبة في 37 درجة مئوية.
    2. الحصاد بنسبة 0.05٪ علاج التريبسين والطرد المركزي. إزالة supernatant وماصة آثار بقايا المتوسطة لتخفيف بيليه الخلية.
    3. إضافة 5 مل من محلول هيبوتونيك. تخلط عن طريق أنبوب مقلوب واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي عند 225 × ز لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يجب أن تظهر بيليه التي تم الحصول عليها رقيق.
    4. إضافة 2.5 مل من الحل المثبت كارنوي ببطء، في حين التنصت لتخفيف بيليه.
    5. إعداد ينتشر لkaryotyping عن طريق إسقاط تعليق الخلية على الشرائح الزجاجية النظيفة.
    6. علاج الشرائح مع 0.15٪ تريبسين لمدة 1 دقيقة, ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. ثم وصمة عار مع حل Giemsa لمدة 4 دقائق وتنتهي مع غسل الماء المقطر. الحصول على ومعالجة مع البرامج المناسبة.
  2. عرض توضيحي للوضع الحر المتحول
    1. عزل الحمض النووي الجينومي
      1. ماصة 20 ميكرولتر من بروتياز في الجزء السفلي من أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
      2. إضافة 200 ميكرولتر من TSiPSCs إعادة الإنفاق في برنامج تلفزيوني إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
      3. إضافة 200 ميكرولتر من AL المخزن المؤقت للعينة ومزيج لمدة 15 ثانية عن طريق دوامة النبض.
      4. حضانة لمدة 10 دقيقة في 56 درجة مئوية.
      5. طرد مركزي لفترة وجيزة أنبوب الطرد المركزي الدقيق لإزالة قطرات من داخل الغطاء.
      6. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول (96-100٪) إلى العينة، واخلط مرة أخرى لمدة 15 ثانية عن طريق دوامة النبض. بعد خلط، طرد مركزي لفترة وجيزة أنبوب لإزالة قطرات من داخل الغطاء.
      7. تطبيق بعناية الخليط من الخطوة السابقة إلى عمود تدور مصغرة (في أنبوب جمع 2 مل) دون التبول الحافة. أغلق الغطاء، واغلق جهاز الطرد المركزي عند 6000 × ز لمدة دقيقة واحدة. تجاهل الأنبوب الذي يحتوي على الخيوط ووضع عمود الدوران المصغر في أنبوب جمع نظيف سعة 2 مل.
      8. افتح عمود الدوران المصغر بعناية وبدون ترطيب الحافة، أضف 500 ميكرولتر من Buffer AW1. أغلق الغطاء والطرد المركزي عند 6000 × ز لمدة دقيقة واحدة. ضع عمود الدوران المصغر في أنبوب جمع نظيف سعة 2 مل وتجاهل أنبوب التجميع الذي يحتوي على الخيوط.
      9. افتح عمود الدوران المصغر بعناية وأضف 500 ميكرولتر من Buffer AW2 دون ترطيب الحافة. أغلق الغطاء والطرد المركزي بأقصى سرعة (20,000 × غرام) لمدة 3 دقائق.
      10. ضع عمود الدوران المصغر في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل وتخلص من أنبوب التجميع القديم مع الخيوط. جهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة للقضاء على فرصة محتملة للنازل AW2 ترحيل.
      11. ضع عمود الدوران المصغر في أنبوب طرد دقيق نظيف سعة 1.5 مل، وتخلص من أنبوب التجميع الذي يحتوي على الخيوط. افتح عمود الدوران المصغر بعناية وأضف 200 ميكرولتر من العازلة AE أو الماء المقطر. احتضان في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق، ومن ثم الطرد المركزي في 6000 × ز لمدة 1 دقيقة.
    2. حالة خالية من المتحولين PCR (باستخدام KAPA HiFi PCR كيت KR0368)
      1. تأكد من أن جميع الكواشف يتم إذابتها بشكل صحيح ومختلطة.
      2. إعداد مزيج رئيسي PCR يحتوي على الحجم المناسب لجميع مكونات التفاعل على أساس الجدول 2 (إعداد ردود الفعل على الجليد).
      3. نقل وحدات التخزين المناسبة من مزيج PCR الرئيسي، قالب والتمهيدي إلى أنابيب PCR الفردية.
      4. الحد الأقصى لردود الفعل الفردية، مزيج والطرد المركزي لفترة وجيزة.
      5. تنفيذ PCR التالية الجدول 3.
  3. تحديد العلامات الحيوية متعددة المؤشرات
    1. الفوسفاتاز القلوية (AP) تلطيخ
      1. إعداد 1x AP يعيش وصمة عار حل العمل عن طريق تخفيف 3 ميكرولتر من محلول الأسهم 500x في 1.5 مل DMEM/F-12 لكل 10 سم2 من منطقة الثقافة.
      2. إزالة المتوسطة من طبق ثقافة iPSC. اغسل الثقافة مع DMEM/F-12 مرة واحدة. إضافة 1x AP حل وصمة عار حية على iPSCs. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
      3. إزالة وصمة عار AP وغسل مرتين مع DMEM / F-12. إضافة جديدة DMEM /F-12 والصورة تحت المجهر الفلورسنت باستخدام مرشح FITC القياسية في غضون 30-90 دقيقة من تلطيخ.
    2. الاحتواء المناعي للمؤشرات الحيوية المتعددة المؤشرات
      1. إصلاح الثقافات iPSC التقاء مع 4٪ بارافورمالديهايد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. اغسل ثلاث مرات مع PBS Tween 20 (PBST)، كل غسل لمدة 5 دقائق.
      2. Permeabilize الخلايا مع 0.3٪ تريتون X-100 في PBST لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل ثلاث مرات مع PBST.
        ملاحظة: يجب أن يتم Permeabilization فقط للمضادات داخل الخلايا.
      3. كتلة الخلايا مع 3٪ ألبوم مصل البقر (BSA) في PBST لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية (المخفف 1:1000 في 1٪ BSA) بين عشية وضحاها. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية، اغسل ثلاث مرات باستخدام PBST.
      4. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية (المخفف 1:1000 في 1٪ BSA) لمدة 5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل ثلاث مرات مع PBST.
      5. تسمية النوى مع 0.5 ميكروغرام / مل 4'، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة دقيقة واحدة. غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
      6. التقاط الصور تحت المجهر الفلوري.

6.في المختبر التمايز المقايسات

  1. تمايز الجسم الجنيني (EB)
    1. قطع مستعمرات iPSC إلى قطع صغيرة، وجمع ولوحة في انخفاض مرفق أطباق بيتري في المتوسط الجسم الجنينية. تنمو الخلايا لمدة 15 يوما عن طريق استبدال المتوسطة كل 3 أيام.
      ملاحظة: يمكن استخدام اليوم 15 EBs مباشرة للكشف عن المؤشرات الحيوية للطبقة الجرثومية الثلاثة. وبدلا من ذلك، يمكن تحريض أنساب خلايا محددة بعوامل النمو، يليها الكشف عن العلامات الحيوية.
  2. تمايز إندوديرم (هيباتوسيت)
    1. تنمو iPSCs في الثقافات أحادية الطبقة في المتوسطة متعددة.
    2. مرة واحدة التقاء, التحول إلى وسائل الإعلام RPMI 1640 مع 1x الأنسولين نقل سيلينيت و 100 نانوغرام / مل activin A لمدة 2 أيام, تليها النمو في وسائل الإعلام RPMI 1640 مع 30 نانوغرام / مل bFGF و 20 نانوغرام / مل BMP4 لمدة 9 أيام. استبدال المتوسطة كل يومين.
    3. من اليوم 10 فصاعدا, تكملة وسائل الإعلام مع 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون. إنهاء التجربة في اليوم 20.
  3. ميسوديرم (عضلة القلب) التمايز
    1. لوحة اليوم 8 EBs على 0.5٪ لوحات المغلفة Matrigel في المتوسط الجسم الجنينية. السماح ل EBs إرفاق وانهيار.
    2. تكملة وسائل الإعلام مع 20 نانوغرام / مل BMP4 وتنمو لمدة 20 يوما. استبدال المتوسطة كل 2-3 أيام. إنهاء التجربة في اليوم 20.
  4. تمايز Ectoderm (العصبية)
    1. لوحة اليوم 4 EBs على 2 ميكروغرام / سم2 الكولاجين نوع IV المغلفة لوحات في المتوسط الجسم الجنيني. السماح ل EBs إرفاق وانهيار.
    2. في اليوم التالي، تحول المتوسطة إلى DMEM F-12 مع الجلوكوز 2mg/mL، 1x الأنسولين نقل سيلينيت، و 2.5μg/mL فيبروكتين. إنهاء التجربة في اليوم 15.
  5. تشكيل الأجهزة العضوية الدماغية
    1. تنمو TSiPSCs في طبق زراعة الأنسجة 35 ملم على MEFs حتى التقاء 70-80٪. قطع المستعمرات وجمع في أنبوب 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 225 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل الناتنات الفائق.
    2. غسل قطعة من المستعمرات عن طريق إعادة تعليق في 2 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي لإزالة supernatant.
    3. إضافة 1 مل من 0.05٪ تريبسين والاستفادة من أنبوب لطرد الخلايا. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 3-4 دقائق ينفصم قطع مستعمرة إلى تعليق خلية واحدة.
    4. تحييد التريبسين عن طريق التخفيف مع 4 مل من وسائل الإعلام متعددة الخلايا التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل كيناز البروتين المرتبطة به (ROCK) مثبط Y-27632 dihydrochloride (ROCKi) لمنع موت الخلايا الناجمة عن التفكك.
    5. الطرد المركزي للحصول على بيليه. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 2mL المتوسطة الجنينية الجسم التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل ROCKi.
    6. إزالة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لعد الخلايا. إضافة 10 ميكرولتر من الأزرق تريبان للكشف عن الخلايا الميتة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    7. إضافة حجم مناسب من المتوسطة الجسم الجنينية مع ROCKi إلى تعليق الخلية للحصول على 9000 الخلايا الحية لكل 150 ميكرولتر.
    8. لوحة 150 ميكرولتر في كل بئر من لوحة منخفضة المرفق 96 جيدا واحتضان في حاضنة CO2 رطبة في 37 درجة مئوية. تحقق من لوحات لتجميع بعد 24 ساعة. في اليوم 2 إزالة بلطف المتوسطة واستبدالها مع المتوسطة الجنينية الطازجة دون ROCKi.
    9. في اليوم 6, نقل EBs إلى آبار مرفق منخفض 24 لوحة البئر التي تحتوي على 500 ميكرولتر من وسيط التعريفي العصبي تتألف من DMEM-F12 مع ملحق N2 1٪ , 2 مل غلوتاماكس الملحق و 1 MM الأحماض الأمينية غير الأساسية و 1 ميكروغرام / مل الهيبارين. تغيير المتوسطة كل يومين.
    10. بعد 5 أيام في وسيط التعريفي العصبي تضمين المجاميع العصبية في Matrigel عن طريق طبقات مربع 2 سم × 2 سم من البارافيلم على صينية تلميح فارغة من نصائح 200 ميكرولتر. اضغط على البارافيلم بأصابع قفازة فوق كل ثقب في صينية البقشيش لصنع خدوش صغيرة. البارافيلم النظيف مع الإيثانول 70٪ لتعقيم.
    11. نقل مربع البارافيلم إلى طبق 60 ملم. استخدام قطع 200 μL نصائح لنقل المجاميع العصبية الإبطية على الخدوش في بارا فيلم. إزالة المتوسطة الزائدة عن طريق pipetting.
    12. إضافة 30 ميكرولتر من Matrigel المذاب على المجاميع العصبية البهلية ووضع المجموع إلى وسط Matrigel باستخدام طرف ماصة. ضع طبق 60 مم لمدة 20-30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية لMatrigel لبوليمرة.
    13. إضافة 5 مل من المتوسط التمايز الجهازي الدماغي تتألف من 1:1 DMEM-F12: المتوسطة العصبية، 0.5٪ N2 الملحق، 2.5 ميكروغرام / مل من الأنسولين، 2 mM GlutaMAX الملحق، 0.5 mM NEAA، 1٪ B27 الملحق و 2.5 مل من البنسلين-streptomycin.
    14. باستخدام ملقط معقم بدوره ورقة parafilm أكثر وتهيج الطبق حتى المجاميع ماتريغل جزءا لا يتجزأ تسقط من ورقة في المتوسط. زيادة المجاميع المضمنة في حاضنةCO2 المرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام مما يعطي تغييرات إعلامية في الأيام البديلة.
    15. بعد 4 أيام من الثقافة الثابتة وضع أطباق 60 ملم على شاكر المدارية المثبتة داخل الحاضنة تهتز في 50 دورة في الدقيقة. ثقافة organoids لمدة 3 أشهر إعطاء تغييرات وسائل الإعلام كاملة مع المتوسطة التمايز الجهازي الدماغي كل 3 أيام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

جيل من iPSCs خالية من التكامل من الجنين المجهض تلقائيا مع 45XO karyotype
عزلنا الخلايا الليفية من FCV مع متلازمة تيرنر (TS) محددة 45XO karyotype وnucleofected لهم مع إعادة برمجة البلازميدات episomal لتوليد TSiPSCs التي يمكن استخدامها لنمذجة المصب من متلازمة, على وجه التحديد العجز العصبي المرتبطة بها (الشكل 1aو b). استخدمنا ناقلات الظهارية غير الصحيحة والنوى لتجارب العدوى(الشكل 1 c&d). تابعنا التغيرات المورفولوجية للخلايا لرصد نجاح إعادة البرمجة. لوحظ التحول من الورم الليفي إلى المورفولوجيا الظهارية ، يليه تشكيل مستعمرة مدمجة محددة(الشكل 2a). اكتسبت TSiPSCs الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مثل مورفولوجيا مع حواف متميزة ونسبة عالية من النواة إلى السيتوبلازم حوالي اليوم 20 بعد العدوى(الشكل 2ب). وعلى النقيض من ذلك، تكتسب الخلايا التي أعيد برمجتها بشكل غير كامل مورفولوجيا ظهارية ولكنها تفشل في تشكيل مستعمرات مدمجة. (الشكل2c).

توصيف مراكز تسيبس
كشفت Karyotyping من TSiPSCs karyotype 45XO المرتبطة متلازمة تيرنر (الشكل 3a). أظهر immunofluorescence من TSiPSCs التعبير عن عوامل النسخ متعددة الخلايا OCT4، NANOG، SOX2، وعلامات سطح الخلية SSEA4، E-Cadherin، وTRA-1-81. الخلايا الجذعية الجنينية البشرية هي المعيار الذهبي للخلايا الجذعية متعددة القدرات. قمنا في وقت واحد immunofluorescence من HUES 1 الذي كان يستخدم كتحكم إيجابي للمقارنة بين التعبير العلامات الحيوية متعددة المؤشرات من قبل TSiPSC (الشكل 3ب). وقد تجلت حالة المتحولين الحرة من TSiPSCs من خلال الحمض النووي الجينوم PCR لعلامات البلازميد الظهارية OriP وEBNA. وبحلول الممر 15، فقدت الجينات أوريب وEBNA في الجينات TSiPSCs.The episomal OriP وEBNA تم تضخيمها وأظهرت العصابات في مرور 9 TSiPSCs تشير إلى وجود البلازميدات الظهارية في هذه المرحلة. ومع ذلك، لم يتم تضخيم هذه الجينات في مرور 15 TSiPSCs تشير إلى فقدان البلازميدات الظهارية وبالتالي حالة خالية من المتحولين جنسيا(الشكل 3c).

في المختبر التمايز المقايسات
وقد تجلت إمكانات التمايز من خطوط TSiPSC في المختبر. شكلت TSiPSCs عند التجميع في لوحات مرفق منخفضة أجسام جنينية(الشكل 4a). واستخدم عامل النمو الذي تسبب في تمايز الخلايا الجذعية المسببة للتشتيبات لتوليد أنواع الخلايا من الطبقات الجرثومية الثلاث. أكد تحليل Immunofluorescence باستخدام المؤشرات الحيوية المحددة النسب أن TSiPSCs تفرقت إلى مشتقات تمثيلية من endoderm (SOX17) ، mesoderm (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα / β) و ectoderm (βIII TUBULIN) (الشكل 4ب).

التمايز الجهازي الدماغي.
تم تمييز TSiPSCs كأعضاء دماغية بطريقة حكيمة في المرحلة. تم تجميع تعليق الخلايا المفردة ل TSiPSCs في أجسام جنينية لتحفيز تطور الطبقات الجرثومية لمدة 6 أيام أولية تليها تحريض التطور العصبي الإبطي لمدة 5 أيام. كانت الظهارة العصبية المجمعة لهم جزءا لا يتجزأ من Matrigel التي وفرت مصفوفة خارج الخلية ومكونات غشاء الطابق السفلي التي تدعم التوجه شبه المداري السليم، والخروج من البراعم العصبية التي تتوسع وتشكل التجويف. Immunofluorescence مع العلامة العصبية الإبطية NESTIN تم تنفيذها لمراقبة مورفولوجيا الشاملة من organoids (الشكل 5ب). يحيط الظهارة العصبية ببطين مثل التجويف(الشكل 5c - الخط الأبيض). تعرض الأجهزة العضوية بشكل شكلي مناطق البطين (VZ) ومنطقة البطين الفرعي (SVZ) والقشرة مثل المناطق(الشكل 5c - الخطوط الحمراء والبرتقالية والصفراء على التوالي)

Figure 1
الشكل 1:عزل الخلايا الليفية وإعادة برمجتها عن طريق التنوب.  (أ) صورة مجهرية للزغب المشيمي الجنيني قبل علاج الكولاجين. (ب) الخلايا الليفية المعزولة عن الزغب المشيمي الجنيني لإجراء تجارب إعادة البرمجة. (ج)التحقق من إعادة برمجة البلازميدات بواسطة عملية الهضم تقييد EcoRI. (د)رسم تخطيطي لبروتوكول العدوى المستخدمة لتوليد iPSC من الخلايا الليفية الشعرية الجنينية باستخدام البلازميدات إعادة برمجة الظهارية عن طريق النيوكليوفيكشن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إنشاء متلازمة تيرنر المستحثة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. (أ)تغيرات مورفولوجيا الخلايا التي لوحظت خلال الدورة الزمنية لإعادة البرمجة. (ب)مستعمرة TSiPSC المبرمجة بالكامل. (ج) صورة تمثيلية للمستعمرة ذات الخلايا المبرمجة بشكل غير صحيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:توصيف مراكز تسيبس.  (أ)كاريوتايب من مراكز تسيبس. (ب)تحليل immunofluorescence من المؤشرات الحيوية متعددة المؤشرات OCT4، NANOG، SOX2، SSEA-4 وTRA-1-81 في TSiPSCs مقارنة مع الخلايا الجذعية الجنينية HUES1. النوى ملطخة 4'، 6-دياميدينو-2-فينيليندول. 3c. عرض توضيحي للوضع الحر المتحول ل TSiPSCs. حارة 1- سلم الحمض النووي، لين 2- OriP السيطرة الإيجابية مع pCXLE-hSK، لين 3- EBNA السيطرة الإيجابية مع pCXLE-hSK، لين 4-OriP مع TSiPSCs، لين 5-EBNA مع TSiPSCs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:إمكانات التمايز في المختبر ل TSiPSCs.  (أ)تميزت TSiPSC إلى الهيئات الجنينية. (ب) تحليلات immunofluorescence من TSiPSCs لعلامات endodermal SOX17، mesodermal علامة الميوزين سلسلة البطين الثقيلة α/β وعلامات ectodermal βIII توبولين وS SOX2. النوى ملطخة 4'، 6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:التمايز العصبي والدماغي العضوي ل TSiPSCs.  (أ)لفهم cytoarchitecture من الخلايا العصبية المتمايزة، تم تلطيخ phalloidin من أكتين. عرضت الخلايا العصبية المشتقة من TSiPSC سوما عصبية على شكل هرم (رأس السهم) مع التشعبات والم أكسون (السهام). النوى ملطخة 4'، 6-دياميدينو-2-فينيليندول. 2 - التثبيط المناعي - لا يمكن أن يكون هناك أي نقص في المناعة (أ) المناعية للنستين وactin لمراقبة مورفولوجيا الإجمالي لل organoids. (ج) تلطيخ لنستين لتصور طبقات الخلايا العصبية منظم بشكل واضح وباسالي. النوى ملطخة 4'، 6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين الوسائط والمخازن المؤقتة والحلول يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: PCR Reaction Mix يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: برنامج ركوب الدراجات PCR الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد توليد نماذج خلوية مستقرة من أنسجة الجنين غير الطبيعية وراثيا ضروريا لإدامة النمط الظاهري المعيب. الطريق iPSC هو الأسلوب الأكثر فعالية لإعداد الخلية للحفاظ الدائم على الخصائص المعيبة20.

الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) عرض خصائص التجديد الذاتي والتمايز في الخلايا المتخصصة تذكرنا الأجنة الانقسام المبكر21. وبالتالي ، يمكن أن تكون PSCs بمثابة نماذج ممتازة لدراسة العيوب الجزيئية والخلوية والتنموية المبكرة في الأجنة المجهضة قبل الأوان.

في هذه المقالة وصفنا جيل iPSC البشري باستخدام النيوكليوفكشن جنبا إلى جنب مع ناقلات الظهارية المحسنة. وتبين النتائج أن هذا المزيج يتضمن طريقة قوية لتوليد خطوط iPSC بشرية خالية من التكامل كما يتضح من حقيقة أن عمليات العدوى المفردة كانت كافية لإعادة البرمجة الناجحة. تتبعنا التحويل التدريجي للخلايا الليفية FCV إلى خلايا متعددة القدرات مجهريا. بعد 20 يوما من العدوى لاحظنا مستعمرات من TSiPSCs المبرمجة محاطة بالخلايا الليفية FCV غير المبرمجة. من الناحية الشكلية، تشبه iPSCs البشرية المشتقة الخلايا الجذعية الجنينية التي تزرع جنبا إلى جنب مع المختبر. بشكل عام، يتم تجميع الخلايا كمستعمرات صغيرة ذات حدود لامعة. كانت خلايا المستعمرات تحتوي على نواة كبيرة ومعبأة بإحكام مما يشير إلى اتصال وثيق بالغشاء بين الخلايا. الخلايا الليفية غير المبرمجة تقوس وتحيط بهذه المستعمرات. وعند نقلها إلى صناديق الاستثمار الصغيرة والمتوسطة الحجم، فإنها تستمر في الانتشار في الثقافة لأكثر من 30 عملية نقل تثبت ممتلكات التجديد الذاتي المستمر.

كما تم إنشاء TSiPSCs من 45XO الخلايا الليفية نحن karyotypeed الخلايا للتحقق مما اذا كانت تحتفظ تكوين الكروموسومات. حافظت TSiPSCs على النمط الكاريوتيبي 45XO في ثقافة الخلية المستمرة مما يشير إلى تركيبة جينية مستقرة للكروموسوم 45XO. لتكون مفيدة كمورد الخلوية التي تمثل 45XO aneuploidy وينبغي أن تكون خالية من TSiPSCs الحمض النووي الخارجية المستخدمة في تجارب إعادة البرمجة. تحققنا من وجود البلازميدات الظهارية المتبقية من خلال إجراء PCR الحمض النووي الجينومي لعلامات محددة الظهارية-OriP وEBNA. لم نجد أي أثر لهذه العلامات في خلايا TSiPS بعد 15 مقطعا تشير إلى أن TSiPSCs فقدت تدريجيا ناقلات إعادة برمجة الظهارية في الثقافة المطولة.

السمة المميزة للخلايا متعددة القدرات هي قدرتها على التمييز إلى خلايا من ثلاثة أنساب جرثومية في المختبر وفي الجسم الحي على حد سواء. لاختبار هذه القدرة في TSiPSCs المستمدة أخضعناها في المختبر لتشكيل الجسم الجنيني واختبارات التمايز الموجهة من قبل النسب تحديد السيتوكينات وعوامل النمو. شكلت TSiPSCs أجسام جنينية وتباينت في خلايا ectodermal تعبر عن علامات الخلايا العصبية ، وخلايا ميسوديرمال التي تعبر عن علامات القلب وخلايا إندوديرال التي تعبر عن SOX17 علامة حيوية لمصير الاندوديرم. اختبرنا أيضا قدرة TSiPSCs للتمييز إلى أعلى ترتيب 3D organoids الدماغي باستخدام بروتوكولات أنشئت سابقا22. TSiPSCs تدريجيا الذاتي تنظيم بسبب برامجها التنموية الجوهرية الخاصة في أنسجة صغيرة تسمى organoids. أسفرت TSiPSCs organoids الدماغي تظهر الخلايا الارتخائية مماثلة لأنسجة الدماغ مع الظهارة العصبية المحيطة البطين مثل تجويف. ومع ذلك يجب أن تتميز هذه الأجهزة العضوية على نطاق واسع للكشف عن أنواع الخلايا الدقيقة ومقارنتها مع iPSCs العادية للتمييز بين خصائص نقش الأنسجة العصبية الجوهرية ل TSiPSCs. يمكن استخدام هذه الأجهزة العضوية الدماغية وأنواع أخرى من الأجهزة العضوية في الدماغ الناتجة عن TSiPSCs لنمذجة التناقضات التنموية والوظيفية التي قد تسهم في أعراض أوجه القصور العصبية لأفراد TS. وأظهرت مراكز مكافحة الأمراض والاتصالات خصائص العلامات البيولوجية للتعددية فضلا عن السمة المميزة للتمايز، مما يبرز نجاح إعادة البرمجة إلى التعددية المستحثة.

وقد عملت الطريقة المذكورة أعلاه بكفاءة في إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية والخلايا المتوسطة المستمدة من مصادر مختلفة في مختبرنا (بيانات الخطوط الأخرى غير مبينة). في تجربتنا، تعتبر الخطوات التالية حاسمة لنجاح تجربة إعادة البرمجة:

أ) نوعية إعداد البلازميد: الاستعدادات القديمة لا تسفر عن iPSCs.
ب) نوعية الخلايا المستخدمة في عمليات العدوى: الخلايا المنتشرة ضرورية لتوليد iPSC. 0.5 إلى 1 مليون خلية لكل إصابة أسفرت عن كفاءة إعادة برمجة قابلة للاستنساخ.
ج) الكواشف النووية المعاد تشكيلها حديثا: لم تسفر الكواشف النووية المعاد تشكيلها المخزنة لأكثر من شهر عن أجهزة iPSCs.
د) صيانة بنك الخلية الرئيسية عن طريق الثقافة الفرعية الميكانيكية لل iPSCs أسفرت عن خطوط مستقرة. تم استخدام التفكك الأنزيمي وفقا لمتطلبات التجربة.

والهدف المستقبلي للمختبر هو إنشاء لجنة من iPSCs غير طبيعية كروموسوميا لتطوير المصب، والنمذجة الوظيفية والمرض باستخدام هذه الطريقة الفعالة. تسبب الاضطرابات الجنينية فقدان الحمل وتشوهات الأعضاء في الولادات الحية. تعتبر iPSCs Aneuploid المشتقة من أنسجة الإجهاض التلقائي موردا قيما لنمذجة ودراسة أحداث النمو الجنينية الفاشلة. في المختبر 2D و 3D نظم الثقافة بما في ذلك الأجسام الجنينية والأنسجة organoids محددة22 ستمكن الباحثين من فهم المخالفات الجزيئية والخلوية مثل انتشار الخلايا الشاذة وموت الخلايا في خلايا محددة النسب التي يمكن أن تظهر كتشوهات النمو وفشل الحمل المرتبطة متلازمات الأنوبلويدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم تقديم الدعم المالي للبحوث المذكورة أعلاه من قبل أكاديمية مانيبال للتعليم العالي. وقد أجري توصيف الخط جزئيا في مختبر م.M. نشكر مختبر أناند التشخيصي على المساعدة في كتابة الكاريوتيبينج.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15% trypsin Thermo Fisher Scientific 27250018 G Banding
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023 Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D8417 Immunocytochemistry
Activin A Sigma Aldrich SRP3003 Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353 AP staining
AMAXA Nucleofector II Lonza - Nucleofection
AmnioMAX II complete media Thermo Fisher Scientific, Gibco 11269016 Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin HiMedia TC021 Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11059 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific, Gibco 15240096 Contamination control
Anti-E-Cadherin BD Biosciences 610181 Immunocytochemistry
Anti-Nanog BD Biosciences 560109 Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4 BD Biosciences 611202 Immunocytochemistry
Anti-SOX17 BD Biosciences 561590 Immunocytochemistry
Anti-SOX2 BD Biosciences 561469 Immunocytochemistry
Anti-SSEA4 BD Biosciences 560073 Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81 Millipore MAB4381 Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] Sigma Aldrich F0291 Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4 Sigma Aldrich SRP3016 Differentiation assays
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059 Blocking
Collagen Human Type IV BD Biosciences 354245 Differentiation assays
Collagenase blend Sigma Aldrich C8051 Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Differentiation assays
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 11320033 Differentiation assays
FastDigest EcoR1 Thermo Scientific FD0274 Restriction digestion
Fibronectin Sigma Aldrich F2518 Differentiation assays
Giemsa Stain HiMedia S011 G Banding
Glacial Acetic Acid HiMedia AS001 Fixative for karyotyping
Glucose Sigma Aldrich G7528 Differentiation assays
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium Sigma Aldrich H3149 Differentiation assays
Insulin solution human Sigma Aldrich I9278 Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite Sigma Aldrich I1884 Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit Kapa Biosystems KR0368 OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid Thermo Fisher Scientific 15210040 Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific 10829018 Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar HiMedia M1151F Plasmid purification
Matrigel BD Biosciences 356234 Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140035 Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol HiMedia MB113 Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β Millipore MAB1552 Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit Lonza VAPD-1001 Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F Addgene 27077 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK Addgene 27078 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL Addgene 27080 Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin   Thermo Fisher Scientific,  15070063 Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma Aldrich P1951 Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep QIAGEN 12143 Plasmid purification
Potassium Chloride Solution HiMedia MB043 Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit Qiagen 51104 Genomic DNA isolation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875093 Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate HiMedia RM255 Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100 HiMedia MB031 Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25300054 Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20 HiMedia MB067 Preparation of PBST
β III tubulin Sigma Aldrich T8578 Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503 Differentiation assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 178، إعادة البرمجة، الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من الإنسان، التشوهات الخلقية، موت الجنين التلقائي، متلازمة تيرنر، العجز العصبي
جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من متلازمة تيرنر (45XO) خلايا الجنين لنمذجة المصب من العجز العصبي المرتبطة متلازمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veerasubramanian, N., Karthikeyan,… More

Veerasubramanian, N., Karthikeyan, V., Hegde, S., Dhanushkodi, A., Parveen, S. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome. J. Vis. Exp. (178), e62240, doi:10.3791/62240 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter