Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering av induserte pluripotente stamceller fra Turners syndrom (45XO) Fosterceller for nedstrøms modellering av nevrologiske underskudd forbundet med syndromet

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/62240
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver genereringen av integrasjonsfrie iPSCer fra fostervevsfibroblaster gjennom levering av episomale plasmider ved kjerneofeksjon etterfulgt av beskrivelse av metoder som brukes til iPSC-karakterisering og nevronal differensiering.

Abstract

Kromosomale aneuploidier forårsaker alvorlige medfødte misdannelser, inkludert misdannelser i sentralnervesystemet og fosterdød. Prenatal genetisk screening er rent diagnostisk og belyser ikke sykdomsmekanismen. Selv om celler fra aneuploidfostre er verdifulle biologiske materialer som bærer kromosomal aneuploidy, er disse cellene kortvarige, noe som begrenser bruken av nedstrøms forskningseksperimenter. Generering av induserte pluripotente stamcellemodeller (iPSC) er en effektiv metode for celleforberedelse for evig bevaring av aneuploide egenskaper. De er selvfornyende og skiller seg ut i spesialiserte celler som minner om embryonal utvikling. Dermed fungerer iPSCer som gode verktøy for å studere tidlige utviklingshendelser. Turner syndrom (TS) er en sjelden tilstand forbundet med et helt eller delvis manglende X-kromosom. Syndromet er preget av infertilitet, kort statur, endokrine, metabolske, autoimmune og kardiovaskulære lidelser og nevrokognitive defekter. Følgende protokoll beskriver isolasjon og dyrking av fibroblaster fra TS (45XO) fostervev, generering av integrasjonsfrie TSiPSCer gjennom levering av episomale omprogrammeringsplasmider ved kjerneavsnitt etterfulgt av karakterisering. Omprogrammeringen av TSiPSCs ble først screenet av alkaliske fosfatasefarging i levende celler etterfulgt av omfattende undersøkelser for pluripotensbiomarkører. Utvalgte kolonier ble mekanisk dissekert, passert flere ganger og stabile selvfornyende celler ble brukt til videre eksperimenter. Cellene uttrykte pluripotenstranskripsjonsfaktorer OCT4, NANOG, SOX2, celleoverflatemarkører SSEA 4 og TRA1-81 typisk for pluripotente stamceller. Den opprinnelige 45XO karyotypen ble beholdt etter omprogrammering. TSiPSCene var i stand til å danne embryoide legemer og differensiere i celler av endoderm, mesoderm og ectoderm som uttrykte avstamningsspesifikke biomarkører ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De eksogene episomale plasmidene gikk tapt spontant og ble ikke oppdaget etter passasje 15 i celler. Disse TSiPSCene er en verdifull cellulær ressurs for modellering av defekt molekylær og cellulær nevroutvikling som forårsaker nevrokognitive underskudd forbundet med Turners syndrom.

Introduction

Aneuploidies fører til fødselsskader/medfødte misdannelser og graviditetstap hos mennesker. ~50%-70% av prøver fra graviditet tap viser cytogenetiske abnormiteter. Aneuploid embryoer tapt tidlig i svangerskapet kan ikke lett oppnås for eksperimentell analyse øke behovet for å utvikle andre modeller som nært representerer menneskelig embryogenese. Induserte pluripotente stamceller (iPSCer) avledet fra celler diagnostisert med genetiske lidelser har blitt brukt til å modellere de representative genetiske uregelmessighetene og deres konsekvens på fosterutvikling1,2,3,4. Disse iPSCene ligner epiblastomer i det utviklende embryoet og kan rekapitulere de tidlige hendelsene i embryodannelse. De tillater forståelse og karakterisering av utviklingsprogrammet for celleavstamninger og mønster i tidlige pattedyrembryoer. iPSCer avledet tidligere fra hudfibroblaster og amniocytter fra prenatale diagnostiske tester av aneuploidy syndromer som monosomi X (Turner syndrom), trisomi 8 (Warkany syndrom 2), trisomi 13 (Patau syndrom) og delvis trisomi 11; 22 (Emanuel syndrom) har gitt verdifull innsikt om mislykket utvikling4.

Turner syndrom (TS) er en sjelden tilstand preget av kvinnelig infertilitet, kort statur, endokrine og metabolske forstyrrelser, økt risiko for autoimmun sykdom og en predisponering for kardiovaskulær sykdom5. Selv om det er det eneste overlevende monosomisyndromet, er det også dødelig for det utviklende embryoet som forårsaker spontane aborter6. Overlevende individer med TS tilstede med grader av endring av X-kromosomalt materiale i sine celler. Karyotyper spenner fra fullstendig tap av ett X-kromosom (45,XO) til mosaikker som 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, tilstedeværelsen av ringkromosomer, tilstedeværelsen av Y-kromosomalt materiale, etc5.

Diagnose av syndromet gjøres vanligvis ved karyotyping blod av symptomatiske individer og chorionic villi sampling (CVS) for å oppdage tidlige aneuploidy syndromer. Siden aneuploidy syndromer står for ~ 30% av spontane aborter, er det rutinemessig å karyotype produktet av unnfangelse (POC) ved en spontan abort. Disse fostercellene, inkludert den chorioniske villi som har cytogenetisk abnormitet og iPSC avledet fra dem, gir en verdifull kilde til biologisk materiale for å studere aneuploidy syndromer4,6. TS iPSCs har tidligere blitt etablert fra amniocytter via retroviral reprogrammering4, fibroblaster av chorionic villi (oppnådd gjennom prenatal diagnose) via retroviral reprogrammering6, fra blod mononukleære celler7 via Sendai virus reprogrammering og fra hudfibroblaster av TS individer via lentiviral reprogrammering4 . Siden hovedfokuset i laboratoriet vårt er å forstå utviklingssvikt, har vi generert TS iPSCer fra POC, spesielt den chorioniske villikomponenten i en spontan abort8. Alle cellene isolert fra dette fostervevet hadde en 45XO karyotype og ga iPSC med samme karyotype. Disse iPSCene er unike da de er de første som genereres fra et abortert foster og gir en verdifull ressurs for å studere aneuploidy relaterte graviditetsfeil. Denne artikkelen gir en detaljert metodikk for generering av iPSCer fra denne unike cellekilden via episomal omprogrammering.

De tidlige metodene for iPSC-generasjonen brukte viral transduksjon og transposoner for å levere omprogrammeringsfaktorene. Metoder for å indusere celler til pluripotency har utviklet seg fra å bruke integrere retrovirale vektorer9, eksiserbare lentivirale vektorer10,11 og transposonbaserte metoder12 til ikke-integrerende adenovirale vektorer13 og Sendai virusbaserte vektorer14. Retroviral og lentiviral basert omprogrammering, selv om det er effektivt, innebærer integrasjon av omprogrammeringsfaktorene i vertskromosomene, noe som forårsaker innsettingsmutasjoner som har uforutsette effekter i iPSCene. Videre forhindrer viral-basert omprogrammering translasjonell anvendelse av iPSCer. RNA-baserte systemer15 og direkte proteinlevering16 er utforsket for å eliminere de potensielle risikoene forbundet med bruk av virus og DNA-transfeksjoner. Imidlertid har disse metodene vist seg ineffektive.

I 2011 rapporterte Okita et al. forbedret effektivitet av omprogrammering ved episomale plasmider forsterket med TP53-undertrykkelse via shRNA. De erstattet også cMYC med ikke-transformerende LMYC (litencellet lungekarsinom assosiert MYC) for å forbedre sikkerheten til hiPSCene. Disse episomale plasmidene uttrykker 5 omprogrammeringsfaktorer: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC og shRNA for TP5317,18. Disse vektorene opprettholdes ekstra kromosomalt og går tapt fra de omprogrammerte cellene ved kontinuerlig kultur, og gjør dermed linjene transgenefrie innen 10-15 passasjer. Kjerneofeksjon er en spesialisert form for elektroporasjon som leverer nukleinsyrer direkte inn i kjernen av vertsceller. Det er en effektiv metode for levering av omprogrammeringsplasmider til ulike celletyper. Episomale plasmider er kostnadseffektive og kompenserer de høye kostnadene ved kjerneofeksjon. Denne metoden er effektiv og reproduserbar under optimaliserte forhold som gir stabile iPSCer fra en rekke somatiske celler. I denne protokollen beskriver vi metoden for generering av iPSCer fra fibroblaster isolert fra fostervev ved kjerneofeksjon av episomale reprogrammeringsplasmider. Her er de detaljerte protokollene for fibroblastisolasjon fra føtal chorionic villi, plasmid rensing, kjerneofeksjon, plukking av kolonier fra omprogrammeringsplaten og etablering av stabile iPSCer.

Det er viktig å bekrefte tilstedeværelsen av pluripotensegenskaper i de nylig genererte iPSCene. Dette inkluderer demonstrasjon av pluripotensrelaterte faktorer (f.eks. alkalisk fosfataseuttrykk, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-kadherin; vanligvis vist med immunfluorescens eller genuttrykksanalyser), identifisering av de tre bakterielagene ved in vitro differensieringsanalyser for å validere deres differensieringspotensialer, karyotyping for å bestemme kromosomalt innhold, STR-skriving for å etablere identitet med foreldreceller, verifisere tap av eksogene gener, bekrefte tap av eksogene gener, og strengere in vivo-analyser som teratomadannelse og tetraploidkomplimentering. Her beskriver vi karakteriseringsprotokoller av karyotyping, levende celler alkalisk fosfatasefarging, påvisning av pluripotensrelaterte biomarkører ved immunfluorescens, in vitro differensieringsanalyser og metode for å demonstrere tap av eksogene gener19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FCV ble hentet fra Manipal Hospital, Bengaluru, under Etikkkomiteen for Manipal Hospitals godkjenning.

MERK: Se tabell 1 for sammensetning av alle buffere og løsninger.

1. Isolering av fibroblaster fra føtal chorionic villi (FCV)

  1. Prøveinnsamling og vevsoppløsing i kollagenalisse
    1. Samle FCV under sterile forhold i fosfatbufret saltvann (PBS) og transport (ved romtemperatur) til cellekulturanlegget.
    2. Overfør villi til en 60 mm Petri-tallerken og vask flere ganger (minimum 4 ganger) i PBS som inneholder 1x antimykotisk oppløsning (PBS-AA). Fjern PBS-AA helt ved å pipettere.
    3. Behandle den chorioniske villi med 1 ml kollagenaseblanding (5 mg/ml) i 5 min ved 37 °C.
    4. Nøytraliser med cellekulturmedium som inneholder 10% foster bovint serum (FBS), overfør fordøye til et 15 ml rør og sentrifuger ved 225 x g i 5 minutter for å samle oppløst villi og frigjorte celler som pellets.
  2. Subkultur og lagerutvidelse
    1. Plate oppløst villi sammen med frigjorte celler i en T25 kultur kolbe som inneholder 5 ml komplette medier (f.eks. AmnioMAX) og vokse til en konfluent fibroblast kultur er oppnådd.
    2. Utvid fibroblaster i kulturen for å forberede lagre for bruk i påfølgende transfeksjons- og karakteriseringseksperimenter som følger:
      1. Tilsett 2 ml 0,05% trypsin til T25 kolbe som inneholder FCV fibroblaster og inkuber ved 37 °C i 3-5 minutter for å fjerne cellene.
      2. Etter inkubasjon nøytraliserer du trypsin ved å legge til FBS (på samme volum som trypsin).
        MERK: Kulturmedium som inneholder FBS kan også brukes til å nøytralisere trypsin, når det legges til med et 1:3 trypsin: medieforhold.
      3. Samle de dissosierte cellene i et 15 ml rør og sentrifuger ved 225 x g i 5 minutter for å få cellepellet.
      4. Dekanter supernatant og resuspendcellepellet i 1 ml komplette medier.
      5. Overfør 500 μL hver til 60 mm vevskulturbehandlede retter og utgjør volumet til 5 ml. Dette delingsforholdet på 1:2 ble også brukt til etterfølgende passasjer.
  3. Kryopreservering
    1. Utfør enzymatisk dissosiasjon ved hjelp av 0,05% trypsin som beskrevet i trinn 1.2.2.1 - 1.2.2.3 og få tak i cellepellet.
    2. Kast supernatanten og resuspend cellepellet i 1 ml fryseblanding, bestående av 1:9 dimetylsulfoksid (DMSO): FBS.
    3. Overfør innholdet til en steril kryo toårig og legg hetteglasset i en frysebeholder.
    4. Frys over natten ved -80 °C, og overfør deretter hetteglassene til flytende nitrogen (-196 °C) dagen etter.

2. Plasmids DNA-isolasjon og verifisering

  1. Bakteriell celleforberedelse
    1. Streak glyserol aksjer av E. coli som inneholder de tre individuelle plasmidene pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK og pCXLE-hUL (fra Addgene) på separate Luria Bertani-ampicillin agar plater.
    2. Inokuler enkeltkolonier i startkulturer på 5 ml Luria Bertani-ampicillin medium. Inkuber i 8 timer ved 37 °C med risting (10 x g).
    3. Inokuler 200 μL av denne startkulturen i 100 ml Luria Bertani-ampicillin medium. Inkuber over natten ved 37 °C med risting.
    4. Høst over natten bakteriekultur ved sentrifugering ved 6000 x g i 15 min ved 4 °C.
  2. Plasmidisolasjon med Midi Plasmid rensesett
    1. Resuspend bakteriell pellets i 4 ml resuspension buffer.
    2. Tilsett 4 ml lysisbuffer og bland grundig ved å kraftig invertere 4-6 ganger og inkubere ved romtemperatur i 5 minutter.
    3. Tilsett 4 ml forhåndskjølt nøytraliseringsbuffer og inverter rør 4-6 ganger for å blande grundig. Inkuber på is i 15 min.
    4. Sentrifuge ved ≥20.000 x g i 30 min ved 4 °C. Samle supernatant i et friskt rør og re-sentrifuge ved ≥20,000 x g i 15 min ved 4 °C.
    5. Likevekt kolonnen ved å bruke 4 ml likevektsbuffer.
    6. Bruk supernatanten på kolonnen.
    7. Vask kolonnen to ganger med 10 ml vaskebuffer.
    8. Elute DNA med 5 ml varm (65 °C) elutionbuffer.
    9. Utfell DNA ved å tilsette 3,5 ml isopropanol til det eluterte DNA-et. Bland godt. Sentrifuge ved ≥ 15 000 x g i 30 min ved 4 °C. Dekanter supernatant forsiktig.
    10. Vask DNA-pelletsen med 2 ml 70% etanol og sentrifuger ved ≥15 000 x g i 10 minutter. Dekanter supernatant forsiktig.
    11. Lufttørk pellets i 5-10 min og oppløs DNA i et passende volum pcr-klasse vann for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 μg / ml.
      MERK: Ikke løs opp DNA i buffere, da det ikke er egnet for elektroporasjon. Gammelt plasmid DNA-preparat gir ikke omprogrammerte kolonier.
  3. Plasmid verifisering ved EcoRI begrensning fordøyelse
    1. Kombiner 15 μL nukleasefritt vann, 2 μL 10x buffer, 1 μg plasmid DNA og 1 μL EcoRI-enzym. Bland forsiktig.
    2. Inkuber blandingen ved 37 °C i 15 minutter i en varmeblokk.
    3. Bland de fordøyde plasmidprøvene med 6x DNA gel lasting fargestoff og elektrofore på 1% agarose gel i 1x TAE buffer med 0,5 μg / ml ethidiumbromid. Inkluder standard DNA-stige. Bilde gelen etter at DNA-et har løst seg på riktig måte. Forventede EcoRI-båndstørrelser på pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F er 6 834 bp, 3 758 bp og 1 108 bp; pCXLE-hUL er 10 200 bp og 1 900 bp. pCXLE-hSK er 10 200 bp og 2500 bp.

3. Nukleofeksjon

  1. Cellepelleting
    1. Kultur de isolerte føtal chorionic villi fibroblaster i T25 kolbe i 5 ml komplette medier til 80-90% samløp.
    2. Vask celler to ganger med PBS og prøv som beskrevet i trinn 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Fjern den supernatante, resuspend pellet i 5 ml reduserte serummedier (f.eks. Tell celler med hemocytometer og ta 106 celler for kjerneofeksjon. Sentrifuge ved 225 x g i 5 min. Fjern supernatant helt.
  2. Reagensforberedelse og kjerneofeksjon
    1. Forbered nukleofektorreagens ved å blande 0,5 ml tilskudd og 2,25 ml nukleofektoroppløsning (begge følger med i settet).
    2. Tilsett 100 μL nukleofektoroppløsning i et 1,5 ml rør. Tilsett 1μg hver av pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK og pCXLE-hUL i røret. Resuspend 106 celler (fra trinn 3.1.2) i denne blandingen.
    3. Overfør celle-DNA-suspensjonen til cuvette, og sørg for at prøven dekker bunnen av cuvette (følger med i settet) uten luftbobler. Hette cuvette og sett den inn i holderen. Velg nukleofector Program U-23 (for høy effektivitet) og bruk.
    4. Fjern cuvette ut av holderen og tilsett 1 ml komplette medier. Overfør innholdet forsiktig til en 60 mm vevskultur behandlet Petri-tallerken fylt med 4 ml komplette medier (til totalt 5 ml medier). Inkuber cellene i en fuktet CO2-inkubator ved 37 °C.
    5. Etter 24 timer, sjekk om cellene har festet seg. Skift ut mediet helt.
      MERK: Frekvensen av celledød er høy i kjerneaveksjon og etterlater få levedyktige celler som festes.
    6. Oppretthold cellene i komplette medier i 10 dager og skift til pluripotensmedier for de neste 20 dagene.
      MERK: Visualiser celler regelmessig for å følge morfologiske endringer som forekommer i omprogrammeringscellene (som epitelmorfologi og kompakt kolonidannelse) for å bekrefte om eksperimentet fungerer. Rundt 25 iPSC-kolonier kan sees etter 20 dager med kultur i pluripotensmedier.

4. Plukking og forplantning av iPSC-kolonier

  1. Plukker koloni fra omprogrammeringsplate
    1. Disseker de embryonale stamcellelignende koloniene som dannes manuelt i omprogrammeringsfatet ved hjelp av trukket glasspipetter eller 1 ml sprøytenåler og overfør til tidligere tilberedt plate med inaktiverte musembryonale fibroblastmatere med pluripotensmedium eller etablere materfrie kulturer på Matrigel-belagte plater med mTESR-medium.
      MERK: Mus embryonale fibroblaster (MEFer) ble avledet ved hjelp av enzymatisk isolasjon fra museembryoer (dissekert fra 13-14 dager gravide kvinnelige mus) og ble mitotically inaktivert ved mitomycin C-behandling. Etablere enkelt klonepopulasjoner ved å dyrke enkeltkolonier fra omprogrammeringsplate i separate retter eller blandede klonepopulasjoner ved å overføre mange kolonier fra omprogrammeringsplate til en enkelt tallerken.
  2. Mekanisk overføring av nye kolonier til ferske matere og passivisering for å etablere stabile iPSCer
    1. Forplant iPSC i pluripotensmedium ved å mate annenhver dag og dele 1:3 hver 5-7 dager. Forbered aksjer ved å kryopreservere i en frysende blanding av KnockOut Serum Replacement og DMSO i forholdet 9:1.
      MERK: KnockOut Serum Replacement brukes i fryseblandingen for kryopreservering av iPSCer i stedet for FBS, da komponenter i FBS kan indusere differensiering av pluripotente celler under langvarig bevaring.

5. Karakterisering av iPSCer

MERK: Karakteriseringsstudier inkludert PCR og immunostaining for pluripotensbiomarkør ble gjort etter det femte passasjenummeret. Karyotyping ble utført på et senere passasjenummer.

  1. Karyotyping
    1. Behandle en sammenhengende 60 mm Petri-tallerken med iPSCer med kolcemid i 45 min i fuktet CO 2-inkubator ved 37 °C.
    2. Høst med 0,05% trypsinbehandling og sentrifuge. Fjern supernatanten og pipette rester av medium for å løsne cellepellet.
    3. Tilsett 5 ml hypotonisk løsning. Bland ved å invertere røret og inkubere i 20 minutter ved 37 °C. Sentrifuge ved 225 x g i 5 min.
      MERK: Den oppnådde pelletsen skal virke myk.
    4. Tilsett 2,5 ml carnoys fikseringsløsning sakte, mens du banker for å løsne pelletsen.
    5. Forbered spreads for karyotyping ved å slippe cellefjæringen på rene glasssklier.
    6. Behandle lysbildene med 0,15% trypsin i 1 minutt, og vask en gang med PBS. Deretter flekker du med Giemsa-oppløsning i 4 min og slutter med destillert vannvask. Anskaffe og behandle med passende programvare.
  2. Demonstrasjon av transgene fri status
    1. Genomisk DNA-isolasjon
      1. Pipette 20 μL protease i bunnen av et 1,5 ml mikrosenterrør.
      2. Tilsett 200 μL TSiPSCer som er resuspendert i PBS til mikrocentrifugerøret.
      3. Tilsett 200 μL Buffer AL i prøven og bland i 15 s ved pulsvirvel.
      4. Inkuber i 10 min ved 56 °C.
      5. Sentrifuger mikrosenterrøret kort for å fjerne dråper fra innsiden av lokket.
      6. Tilsett 200 μL etanol (96-100%) i prøven, og bland igjen i 15 s ved pulsvirvel. Etter blanding sentrifugerer du kort røret for å fjerne dråper fra innsiden av lokket.
      7. Påfør blandingen forsiktig fra forrige trinn til minispinsøylen (i et 2 ml oppsamlingsrør) uten å fukte felgen. Lukk hetten og sentrifugen på 6000 x g i 1 min. Kast røret som inneholder filtratet, og plasser minispinsøylen i et rent 2 ml oppsamlingsrør.
      8. Åpne minispinsøylen forsiktig, og uten å fukte felgen, tilsett 500 μL buffer AW1. Lukk hetten og sentrifugen på 6000 x g i 1 min. Plasser minispinsøylen i et rent 2 ml oppsamlingsrør og kast oppsamlingsrøret som inneholder filtratet.
      9. Åpne minispinsøylen forsiktig og tilsett 500 μL Buffer AW2 uten å fukte felgen. Lukk hetten og sentrifugen med full hastighet (20 000 x g) i 3 minutter.
      10. Plasser minispinsøylen i et nytt 2 ml oppsamlingsrør og kast det gamle oppsamlingsrøret med filtratet. Sentrifuger med full hastighet i 1 min for å eliminere sjansen for mulig Buffer AW2-overføring.
      11. Plasser minispinsøylen i et rent 1,5 ml mikrosenterrør, og kast oppsamlingsrøret som inneholder filtratet. Åpne minispinsøylen forsiktig og tilsett 200 μL buffer AE eller destillert vann. Inkuber ved romtemperatur (15-25 °C) i 5 min, og sentrifuger deretter ved 6000 x g i 1 min.
    2. Transgene-free status PCR (Bruke KAPA HiFi PCR Kit KR0368)
      1. Forsikre deg om at alle reagenser er riktig tint og blandet.
      2. Klargjør en PCR-masterblanding som inneholder riktig volum av alle reaksjonskomponenter basert på tabell 2 (sett opp reaksjoner på is).
      3. Overfør de riktige volumene av PCR master mix, mal og primer til individuelle PCR-rør.
      4. Cap individuelle reaksjoner, bland og sentrifuge kort.
      5. Utfør PCR ved å følge tabell 3.
  3. Pluripotency biomarkør identifikasjon
    1. Alkalisk fosfatase (AP) farging
      1. Forbered en 1x AP levende flekk arbeidsløsning ved å fortynne 3 μL 500x lagerløsning i 1,5 ml DMEM / F-12 for hver 10 cm2 kulturområde.
      2. Fjern mediet fra iPSC-kulturretten. Vask kulturen med DMEM/F-12 en gang. Legg til 1x AP live flekkløsning på iPSCene. Inkuber ved 37 °C i 45 minutter.
      3. Fjern AP-flekken og vask to ganger med DMEM/F-12. Tilsett fersk DMEM/F-12 og bilde under fluorescerende mikroskop ved hjelp av et standard FITC-filter innen 30-90 min flekker.
    2. Immunstaining for pluripotensbiomarkører
      1. Løs sammenfallende iPSC-kulturer med 4% paraformaldehyd over natten ved 4 °C. Vask tre ganger med PBS Tween 20 (PBST), hver vask i 5 min.
      2. Permeabiliser cellene med 0,3% Triton X-100 i PBST i 15 minutter ved romtemperatur. Vask tre ganger med PBST.
        MERK: Permeabilisering bør kun gjøres for intracellulære antigener.
      3. Blokker celler med 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBST i 30 minutter ved romtemperatur. Flekk cellene med primære antistoffer (fortynnet 1:1000 i 1% BSA) over natten. Etter primær antistoffinkubasjon, vask tre ganger med PBST.
      4. Inkuber celler med sekundært antistoff (fortynnet 1:1000 i 1% BSA) i 5 timer ved romtemperatur. Vask tre ganger med PBST.
      5. Merk kjernen med 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 1 minutt. Vask cellene en gang med PBST.
      6. Ta bilder under fluorescerende mikroskop.

6.In vitro differensieringsanalyser

  1. Embryoid Kropp (EB) Differensiering
    1. Klipp iPSC-koloniene i små biter, samle og tallerken i lavt feste Petri retter i embryoid kroppsmedium. Utvid cellene i 15 dager ved å erstatte medium hver tredje dag.
      MERK: Dagen 15 EB kan brukes direkte til påvisning av de tre bakterielagbiomarkørene. Alternativt kan spesifikke celleavledninger induseres med vekstfaktorer, etterfulgt av biomarkørdeteksjon.
  2. Endoderm (Hepatocyte) differensiering
    1. Utvid iPSCene i monolayerkulturer i pluripotensmedium.
    2. Når sammenløpet, skift til RPMI 1640 medier med 1x Insulin Transferrin Selenite og 100 ng/ml aktivin A i 2 dager, etterfulgt av vekst i RPMI 1640 medier med 30 ng/ml bFGF og 20 ng/ml BMP4 i 9 dager. Skift ut medium annenhver dag.
    3. Fra dag 10 og utover, supplement media med 0,1 μM deksametason. Avslutt eksperimentet på dag 20.
  3. Mesoderm (Kardiomyocytt) differensiering
    1. Plate dag 8 EBs på 0,5% Matrigel-belagte plater i embryoid kroppen medium. La EB-ene feste og skjule.
    2. Supplere media med 20 ng/ml BMP4 og vokse i 20 dager. Skift ut medium hver 2-3 dager. Avslutt eksperimentet på dag 20.
  4. Etoderm (Neuronal) differensiering
    1. Plate dag 4 EB på 2 μg/cm2 kollagen type IV-belagte plater i embryoid kroppsmedium. La EB-ene feste og skjule.
    2. Neste dag, skift medium til DMEM F-12 med 2mg/ml glukose, 1x Insulin Transferrin Selenitt og 2,5 μg/ml fibronektin. Avslutt eksperimentet på dag 15.
  5. Dannelse av cerebral organoider
    1. Vokse TSiPSCs i en 35 mm vev kultur parabolen på MEFs til 70-80% confluent. Klipp koloniene og samle i et 15 ml rør. Sentrifuger cellene ved 225 x g i 5 min. Kast supernatanten.
    2. Vask kolonbitene ved å resuspendere i 2 ml PBS og sentrifuge for å fjerne supernatanten.
    3. Tilsett 1 ml 0,05% trypsin og trykk på røret for å løsne cellene. Inkuber røret ved 37 °C i 3-4 min for å fjerne kolonistykkene i en enkeltcellet suspensjon.
    4. Nøytraliser trypsin ved fortynning med 4 ml pluripotensmedier som inneholder 10 μg/ml rho-assosiert proteinkinase (ROCK)-hemmer Y-27632 dihydroklorid (ROCKi) for å forhindre dissosiasjon indusert celledød.
    5. Sentrifuge for å få en pellets. Kast supernatanten og resuspend cellene i 2ml embryoid kroppsmedium som inneholder 10 μg / ml ROCKi.
    6. Fjern 10 μL cellesuspensjon for celletelling. Tilsett 10 μL Trypan blå for å oppdage døde celler. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
    7. Tilsett passende volum av embryoid kroppsmedium med ROCKi til cellefjæringen for å oppnå 9000 levende celler per 150 μL.
    8. Plate 150 μL i hver brønn av en lav-feste 96-brønns plate og inkubere i en fuktet CO2 inkubator ved 37 °C. Kontroller platene for aggregering etter 24 timer. På dag 2 fjern forsiktig mediet og erstatt med friskt embryoid medium uten ROCKi.
    9. På dag 6, overfør EBs til brønner med lav vedlegg 24 brønnplate som inneholder 500 μL nevral induksjonsmedium sammensatt av DMEM-F12 med 1% N2 supplement, 2 mM GlutaMAX supplement og 1 mM ikke-essensielle aminosyrer og 1 μg / ml heparin. Bytt medium annenhver dag.
    10. Etter 5 dager i nevral induksjonsmedium legger du inn nevroepitheliale aggregater i Matrigel ved å legge en 2 cm x 2 cm firkant av parafilm over en tom spissbrett på 200 μL spisser. Trykk parafilm med hanskede fingre over hvert hull i spissbrettet for å lage små bulker. Rengjør parafilm med 70% etanol for å sterilisere.
    11. Overfør parafilmplassen til en 60 mm tallerken. Bruk kutt 200 μL tips for å overføre nevroepitheliale aggregater på bulkene i parafilm. Fjern overflødig medium ved pipettering.
    12. Tilsett 30 μL tint Matrigel på nevroepithlial aggregatene og plasser aggregatet til midten av matrigelen ved hjelp av en pipettespiss. Plasser 60 mm parabolen i 20-30 min i en 37 °C inkubator for matrigelen å polymerisere.
    13. Tilsett 5 ml cerebral organoid differensieringsmedium sammensatt av 1:1 DMEM-F12: Neurobasal medium, 0,5% N2 supplement, 2,5 μg/ml insulin, 2 mM GlutaMAX supplement, 0,5 mM NEAA, 1% B27 supplement og 2,5 ml penicillin-streptomycin.
    14. Bruk sterile tang til å snu parafilmarket og rør opp fatet til de innebygde aggregatene i Matrigel faller av arket i mediet. Øk de innebygde aggregatene i en fuktet CO 2-inkubator ved 37 °C i 4 dager, noe som gir medieendringer på alternative dager.
    15. Etter 4 dager med statisk kultur plasser de 60 mm rettene på en orbital shaker installert inne i inkubatoren risting ved 50 rpm. Kultur organoidene i 3 måneder gir komplette medieforandringer med cerebral organoid differensieringsmedium hver tredje dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering av integrasjonsfrie iPSCer fra et spontant abortert foster med 45XO karyotype
Vi isolerte fibroblaster fra FCV med et Turner syndrom (TS) spesifikk 45XO karyotype og nukleofekterte dem med episomale reprogrammeringsplasmider for å generere TSiPSCer som kan brukes til nedstrøms modellering av syndromet, spesielt de tilhørende nevrologiske underskuddene (Figur 1a&b). Vi brukte ikke-episomale vektorer og kjerneaveksjon for transfeksjonsforsøkene (Figur 1 c&d). Vi fulgte morfologiske endringer i celler for å overvåke suksessen med omprogrammering. Skiftet fra fibroblaster til epitelmorfologi, etterfulgt av en avgrenset kompakt koloniformasjon ble observert (Figur 2a). TSiPSCer kjøpte human embryonal stamcelle som morfologi med distinkte kanter og et høyt nukleus-til-cytoplasmaforhold rundt dag 20 etter transfeksjon (Figur 2b). I motsetning til dette får ufullstendig omprogrammerte celler epitelale morfologier, men klarer ikke å danne kompakte kolonier. (Figur 2c).

Karakterisering av TSiPSCer
Karyotyping av TSiPSCer avslørte 45XO karyotype assosiert med Turner Syndrome (Figur 3a). Immunfluorescens av TSiPSCer viste uttrykk for pluripotenstranskripsjonsfaktorer OCT4, NANOG, SOX2 og celleoverflatemarkører SSEA4, E-Cadherin og TRA-1-81. Humane embryonale stamceller er gullstandarden for pluripotente stamceller. Vi utførte samtidig immunfluorescens av HUES 1 som ble brukt som positiv kontroll for sammenligning av pluripotensbiomarkøruttrykk av TSiPSC (Figur 3b). Transgenes frie status for TSiPSCene ble demonstrert av et genomisk DNA PCR for episomale plasmidmarkører OriP og EBNA. Ved passering 15, OriP og EBNA genet gikk tapt i TSiPSCs.The episomale gener OriP og EBNA ble forsterket og viste band i passasje 9 TSiPSCs indikerer tilstedeværelsen av episomale plasmider på dette stadiet. Disse genene ble imidlertid ikke forsterket i passasje 15 TSiPSCer som indikerer tap av episomale plasmider og dermed en transgene fri tilstand (Figur 3c).

In vitro differensieringsanalyser
Differensieringspotensialet til TSiPSC-linjer ble demonstrert in vitro. TSiPSC ved aggregering i lave festeplater dannet embryoide legemer (Figur 4a). Vekstfaktorindusert differensiering av TSiPSCer ble brukt til å generere celletyper av de tre bakterielagene. Immunfluorescence analyse ved hjelp av avstamning spesifikke biomarkører bekreftet at TSiPSCs differensiert i representative derivater av endoderm (SOX17), mesoderm (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β) og ectoderm (βIII TUBULIN) (Figur 4b).

Cerebral organoid differensiering.
TSiPSCs ble differensiert som cerebral organoider på en scenemessig klok måte. Encellede suspensjoner av TSiPSCer ble aggregert i embryoide kropper for å stimulere utviklingen av bakterielag i de første 6 dagene etterfulgt av induksjon av nevroepithelial utvikling i 5 dager. Nevroepithelial aggregert var dem innebygd i Matrigel som ga den ekstracellulære matrisen og kjellermembrankomponentene som støtter riktig apicobasal orientering, utvekst av nevroepitheliale knopper som utvider og danner lumen. Immunfluorescens med nevroepithelial markør NESTIN ble utført for å observere organoidenes generelle morfologi (figur 5b). Nevroepitheliet omgir en ventrikel som hulrom (Figur 5c - hvit linje). Organoidene viser morfologisk ventrikulære soner (VZ), sub ventrikkelsone (SVZ) og cortex som regioner (henholdsvisfigur 5c - røde, oransje og gule linjer)

Figure 1
Figur 1: Fibroblastisolasjon og omprogrammering via kjerneofeksjon.  (a) Mikroskopisk bilde av føtal chorionic villi før kollagenal behandling. (b) Fibroblaster isolert fra foster chorionic villi for omprogrammering eksperimenter. (c) Verifisering av omprogrammering av plasmider ved EcoRI-begrensningsfordøyeleggelse. (d) Skjematisk diagram over transfeksjonsprotokoll som brukes til iPSC-generasjon fra føtal chorioniske villi fibroblaster ved hjelp av episomale reprogrammeringsplasmider via kjerneofeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Etablering av Turner syndrom induserte pluripotente stamceller. (a) Cellemorfologiendringer observert i løpet av omprogrammeringstidspunktet. (b) En fullstendig omprogrammert TSiPSC-koloni. (c) Et representativt bilde av en koloni med feil omprogrammerte celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering av TSiPSCer.  (a) Karyotype for TSiPSCer. (b) Immunfluorescensanalyse av pluripotensbiomarkører OCT4, NANOG, SOX2, SSEA-4 og TRA-1-81 i TSiPSCer sammenlignet med embryonal stamcelle HUES1. Kjerner er farget med 4', 6-diamidino-2-fenylindol. 3c. Demonstrasjon av transgene fri status for TSiPSCer. Lane 1- DNA-stige, Lane 2- OriP positiv kontroll med pCXLE-hSK, Lane 3- EBNA positiv kontroll med pCXLE-hSK, Lane 4-OriP med TSiPSCs, Lane 5-EBNA med TSiPSCs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: In vitro differensieringspotensial for TSiPSCer.  (a) TSiPSC differensiert til embryoide legemer. (b) Immunfluorescence analyser av TSiPSCs for endodermal markør SOX17, mesodermal markør myosin ventrikulært tungt kjede α / β og ektodermale markører βIII tubulin og SOX2. Kjerner er farget med 4', 6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Neuronal og cerebral organoid differensiering av TSiPSC.  (a) For å forstå cytoarkitektur av differensierte nevroner, ble falloidinfarging av Actin gjort. TSiPSC-avledede nevroner viste pyramideformede nevronale soma (pilspiss) med dendritter og aksoner (piler). Kjerner er farget med 4', 6-diamidino-2-fenylindol. Immunstaining. (a) Immunostaining for Nestin og aktin for å observere organoidenes grove morfologi. (c) Farging for Nestin for å visualisere de apically og basally organiserte nevronale lagene. Kjerner er farget med 4', 6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammensetning av medier, buffere og løsninger Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: PCR Reaksjonsmiks Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: PCR Sykkelprogram Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generering av stabile cellulære modeller av cytogenetisk unormalt fostervev er nødvendig for å opprettholde defekt fenotype. IPSC-ruten er den mest effektive metoden for celleforberedelse for evig bevaring av defekte egenskaper20.

Pluripotente stamceller (PSC) viser egenskaper til selvfornyelse og differensiering i spesialiserte celler som minner om tidlige spaltingsembryoer21. Derfor kan PSCer tjene som gode modeller for å studere tidlige molekylære, cellulære og utviklingsmessige feil hos for tidlig aborterte fostre.

I denne artikkelen har vi beskrevet menneskelig iPSC-generasjon ved hjelp av kjerneofeksjon kombinert med de forbedrede episomale vektorene. Resultatene viser at denne kombinasjonen består av en robust metode for å generere integrasjonsfrie menneskelige iPSC-linjer som det fremgår av det faktum at enkelttransfeksjoner var tilstrekkelig for vellykket omprogrammering. Vi sporet den progressive konverteringen av FCV-fibroblaster til pluripotente celler mikroskopisk. 20 dager etter transfeksjon observerte vi kolonier av omprogrammerte TSiPSCer omgitt av ikke-omprogrammerte FCV-fibroblaster. Morfologisk lignet de avledede menneskelige iPSCene embryonale stamceller som vokste sammen i laboratoriet. Vanligvis er cellene aggregert som kompakte kolonier med skinnende kantlinjer. Cellene i koloniene hadde store kjerner og tett pakket som tyder på nær membrankontakt mellom cellene. De ikke-omprogrammerte fibroblaster buet og omringet disse koloniene. Ved overføring til iMEF-er fortsetter de å spre seg i kultur for over 30 overføringer som demonstrerer eiendommen til fortsatt selvfornyelse.

Ettersom TSiPSCs ble generert fra 45XO fibroblaster, karyotypet vi cellene for å sjekke om de beholdt kromosomsammensetningen. TSiPSCene opprettholdt 45XO karyotypen i celle kontinuerlig kultur som antyder en stabil 45XO kromosom genetisk sminke. For å være nyttig som cellulær ressurs som representerer 45XO aneuploidy bør TSiPSCene være fri for eksogent DNA som brukes i omprogrammeringsforsøkene. Vi sjekket tilstedeværelsen av gjenværende episomale plasmider ved å utføre et genomisk DNA PCR for episomale spesifikke markører-OriP og EBNA. Vi fant ingen spor av disse markørene i TSiPS-celler etter 15 passasjer som antyder at TSiPSCene gradvis mistet episomale omprogrammeringsvektorer i langvarig kultur.

Kjennetegnet på en pluripotent celler er dens potensial til å skille til celler av tre bakterie avledninger både in vitro og in vivo. For å teste denne evnen i de avledede TSiPSCene utsatte vi dem in vitro for embryoid kroppsdannelse og differensieringsanalyser rettet mot avstamning som spesifiserer cytokiner og vekstfaktorer. TSiPSCs dannet embryoide kropper og differensiert i ektodermale celler som uttrykte nevronale markører, mesodermale celler som uttrykte hjertemarkører og endodermale celler som uttrykker SOX17 en biomarkør for endoderm skjebne. Vi testet også TSiPSCs evne til å skille seg ut i høyere rekkefølge 3D cerebral organoider ved hjelp av tidligere etablerte protokoller22. TSiPSCs gradvis selvorganisere på grunn av sine egne iboende utviklingsprogrammer i mini vev kalt organoider. TSiPSCs ga cerebral organoider som viste en cytoarkittur som ligner hjernevev med nevroepithelium rundt en ventrikel som hulrom. Imidlertid må disse organoidene karakteriseres ytterligere mye for å avsløre de eksakte celletypene og sammenlignet med normale iPSCer for å skille de iboende nevrale vevsmønsteregenskapene til TSiPSCer. Disse cerebral organoider og andre typer hjerneorganoider generert fra TSiPSCs kan brukes til å modellere utviklingsmessige og funksjonelle inkonsekvenser som kan bidra til symptomene på nevrologiske mangler hos TS-individer. TSiPSCs viste biomarkøregenskaper av pluripotens samt kjennetegnet på differensiering og fremhevet dermed suksessen med omprogrammering til indusert pluripotens.

Den ovenfor beskrevne metoden har arbeidet effektivt med omprogrammering av dermale fibroblaster og mesenchymale celler avledet fra ulike kilder i laboratoriet vårt (data fra andre linjer ikke vist). Vår erfaring er at følgende trinn er avgjørende for at omprogrammeringseksperimentet skal lykkes:

a) Kvalitet på plasmidpreparat: gamle preparater gir ikke iPSCer.
b) Kvalitet på celler som brukes til transfeksjoner: proliferating celler er avgjørende for iPSC-generering. 0,5 til 1 million celler per transfeksjon ga en reproduserbar omprogrammeringseffektivitet.
c) Nyrekonstituerte nukleofektorreagenser: rekonstituerte nukleofektorreagenser lagret i over en måned ga ikke iPSCer.
d) Vedlikehold av mastercellebank ved mekanisk subkultur av iPSCene ga stabile linjer. Enzymatisk dissosiasjon ble brukt i henhold til eksperimentkrav.

Laboratoriets fremtidige mål er å etablere et panel av kromosomalt unormale iPSCer for nedstrøms utvikling, funksjonell og sykdomsmodellering ved hjelp av denne effektive metoden. Føtal aneuploidies forårsaker graviditet tap og organ misdannelser i levende fødsler. Aneuploid iPSC avledet fra vev av spontane abortuses er en verdifull ressurs for å modellere og studere mislykkede embryonale utviklingshendelser. In vitro 2D og 3D kultursystemer inkludert embryoide kropper og vev spesifikke organoider22 vil gjøre det mulig for forskere å forstå molekylære og cellulære uregelmessigheter som avvikende celleproliferasjon og celledød i avstamning spesifikke celler som kan manifestere seg som utviklingsavvik og graviditetssvikt forbundet med aneuploidy syndromer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Økonomisk støtte til ovennevnte forskning ble gitt av Manipal Academy of Higher Education. Karakterisering av linjen ble utført delvis i laboratoriet til M.M. Panicker ved NCBS. Vi takker Anand Diagnostisk Laboratorium for hjelp med karyotyping.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15% trypsin Thermo Fisher Scientific 27250018 G Banding
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023 Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D8417 Immunocytochemistry
Activin A Sigma Aldrich SRP3003 Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353 AP staining
AMAXA Nucleofector II Lonza - Nucleofection
AmnioMAX II complete media Thermo Fisher Scientific, Gibco 11269016 Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin HiMedia TC021 Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11059 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific, Gibco 15240096 Contamination control
Anti-E-Cadherin BD Biosciences 610181 Immunocytochemistry
Anti-Nanog BD Biosciences 560109 Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4 BD Biosciences 611202 Immunocytochemistry
Anti-SOX17 BD Biosciences 561590 Immunocytochemistry
Anti-SOX2 BD Biosciences 561469 Immunocytochemistry
Anti-SSEA4 BD Biosciences 560073 Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81 Millipore MAB4381 Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] Sigma Aldrich F0291 Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4 Sigma Aldrich SRP3016 Differentiation assays
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059 Blocking
Collagen Human Type IV BD Biosciences 354245 Differentiation assays
Collagenase blend Sigma Aldrich C8051 Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Differentiation assays
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 11320033 Differentiation assays
FastDigest EcoR1 Thermo Scientific FD0274 Restriction digestion
Fibronectin Sigma Aldrich F2518 Differentiation assays
Giemsa Stain HiMedia S011 G Banding
Glacial Acetic Acid HiMedia AS001 Fixative for karyotyping
Glucose Sigma Aldrich G7528 Differentiation assays
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium Sigma Aldrich H3149 Differentiation assays
Insulin solution human Sigma Aldrich I9278 Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite Sigma Aldrich I1884 Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit Kapa Biosystems KR0368 OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid Thermo Fisher Scientific 15210040 Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific 10829018 Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar HiMedia M1151F Plasmid purification
Matrigel BD Biosciences 356234 Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140035 Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol HiMedia MB113 Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β Millipore MAB1552 Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit Lonza VAPD-1001 Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F Addgene 27077 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK Addgene 27078 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL Addgene 27080 Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin   Thermo Fisher Scientific,  15070063 Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma Aldrich P1951 Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep QIAGEN 12143 Plasmid purification
Potassium Chloride Solution HiMedia MB043 Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit Qiagen 51104 Genomic DNA isolation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875093 Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate HiMedia RM255 Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100 HiMedia MB031 Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25300054 Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20 HiMedia MB067 Preparation of PBST
β III tubulin Sigma Aldrich T8578 Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503 Differentiation assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 178 reprogrammering menneskeskapte pluripotente stamceller aneuploidier medfødte misdannelser spontan fosterdød turnersyndrom nevrologiske underskudd
Generering av induserte pluripotente stamceller fra Turners syndrom (45XO) Fosterceller for nedstrøms modellering av nevrologiske underskudd forbundet med syndromet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veerasubramanian, N., Karthikeyan,… More

Veerasubramanian, N., Karthikeyan, V., Hegde, S., Dhanushkodi, A., Parveen, S. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome. J. Vis. Exp. (178), e62240, doi:10.3791/62240 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter