Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir del síndrome de Turner (45XO) células fetales para el modelado posterior de déficits neurológicos asociados con el síndrome
Summary
Este protocolo describe la generación de iPSC libres de integración a partir de fibroblastos de tejido fetal a través de la administración de plásmidos episomales por nucleofection seguido de la descripción de los métodos utilizados para la caracterización de iPSC y la diferenciación neuronal.
Abstract
Las aneuploidias cromosómicas causan malformaciones congénitas graves, incluidas malformaciones del sistema nervioso central y muerte fetal. El cribado genético prenatal es puramente diagnóstico y no aclara el mecanismo de la enfermedad. Aunque las células de fetos aneuploides son material biológico valioso que soporta la aneuploidía cromosómica, estas células son de corta duración, lo que limita su uso para experimentos de investigación posteriores. La generación de modelos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) es un método eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de rasgos aneuploides. Se autorrenovan y se diferencian en células especializadas que recuerdan al desarrollo embrionario. Por lo tanto, las iPSC sirven como excelentes herramientas para estudiar los eventos tempranos del desarrollo. El síndrome de Turner (TS) es una afección rara asociada con la falta total o parcial de un cromosoma X. El síndrome se caracteriza por infertilidad, baja estatura, trastornos endocrinos, metabólicos, autoinmunes y cardiovasculares y defectos neurocognitivos. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de fibroblastos a partir de tejido fetal TS (45XO), generación de TSiPSC libres de integración a través de la entrega de plásmidos de reprogramación episomal por nucleofection seguido de caracterización. Las TSiPSC de reprogramación se examinaron inicialmente mediante tinción de fosfatasa alcalina de células vivas seguida de un sondeo extenso para detectar biomarcadores de pluripotencia. Las colonias seleccionadas fueron diseccionadas mecánicamente, pasadas varias veces y se utilizaron células estables autorrenovadoras para experimentos posteriores. Las células expresaron factores de transcripción de pluripotencia OCT4, NANOG, SOX2, marcadores de superficie celular SSEA 4 y TRA1-81 típicos de las células madre pluripotentes. El cariotipo 45XO original se mantuvo después de la reprogramación. Las TSiPSCs fueron capaces de formar cuerpos embrioides y diferenciarse en células de endodermo, mesodermo y ectodermo expresando biomarcadores específicos del linaje ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Los plásmidos episomales exógenos se perdieron espontáneamente y no se detectaron después del paso 15 en las células. Estas TSiPSC son un valioso recurso celular para modelar el neurodesarrollo molecular y celular defectuoso que causa déficits neurocognitivos asociados con el síndrome de Turner.
Introduction
Las aneuploidies conducen a defectos de nacimiento / malformaciones congénitas y pérdida del embarazo en humanos. ~ 50% -70% de las muestras de pérdidas de embarazo muestran anomalías citogenéticas. Los embriones aneuploides perdidos al principio del embarazo no se pueden obtener fácilmente para el análisis experimental, lo que plantea la necesidad de desarrollar otros modelos que representen estrechamente la embriogénesis humana. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células diagnosticadas con trastornos genéticos se han utilizado para modelar las irregularidades genéticas representativas y su consecuencia en el desarrollo fetal1,2,3,4. Estas iPSC se asemejan a las células epiblásticas del embrión en desarrollo y pueden recapitular los eventos tempranos de formación embrionaria. Permiten comprender y caracterizar el programa de desarrollo de los linajes celulares y el modelado en embriones de mamíferos tempranos. iPSCs derivadas previamente de fibroblastos cutáneas y amniocitos de pruebas diagnósticas prenatales de síndromes de aneuploidía como monosomía X (síndrome de Turner), trisomía 8 (síndrome de Warkany 2), trisomía 13 (síndrome de Patau) y trisomía parcial 11; 22 (síndrome de Emanuel) han proporcionado información valiosa sobre el desarrollo fallido4.
El síndrome de Turner (STT) es una afección rara caracterizada por infertilidad femenina, baja estatura, trastornos endocrinos y metabólicos, un mayor riesgo de enfermedad autoinmune y una predisposición a la enfermedad cardiovascular5. Aunque es el único síndrome de monosomía que puede superar, también es letal para el embrión en desarrollo causando abortos espontáneos6. Los individuos sobrevivientes con SST presentan grados de alteración del material cromosómico X en sus células. Los cariotipos van desde la pérdida completa de un cromosoma X (45,XO) hasta mosaicos como 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presencia de cromosomas en anillo, la presencia de material cromosómico Y,etc. 5.
El diagnóstico del síndrome generalmente se realiza mediante el cariotipo de sangre de individuos sintomáticos y el muestreo de vellosidades coriónicas (CVS) para detectar síndromes de aneuploidía temprana. Dado que los síndromes de aneuploidía representan ~ 30% de los abortos espontáneos, es rutinario cariotipar el producto de la concepción (POC) en un aborto espontáneo. Estas células fetales, incluidas las vellosidades coriónicas que poseen la anomalía citogenética y las iPSC derivadas de ellas, proporcionan una valiosa fuente de material biológico para estudiar los síndromes de aneuploidía4,6. Las iPSC de TS se han establecido previamente a partir de amniocitos a través de la reprogramación retroviral4,fibroblastos de vellosidades coriónicas (obtenidos a través del diagnóstico prenatal) a través de la reprogramación retroviral6,de células mononucleares sanguíneas7 a través de la reprogramación del virus de Sendai y de fibroblastos de la piel de los individuos de TS a través de la reprogramación lentiviral4 . Dado que el enfoque principal de nuestro laboratorio es comprender el fracaso del desarrollo, hemos generado IPSC TS a partir de POC, específicamente el componente de vellosidades coriónicas de un aborto espontáneo8. Todas las células aisladas de este tejido fetal tenían un cariotipo 45XO y producían iPSCs con el mismo cariotipo. Estas iPSC son únicas, ya que son las primeras que se generan a partir de un feto abortado y proporcionan un recurso valioso para estudiar las fallas del embarazo relacionadas con la aneuploidía. Este artículo proporciona una metodología detallada de la generación de iPSC a partir de esta fuente celular única a través de la reprogramación episomal.
Los primeros métodos de generación de iPSC utilizaron la transducción viral y los transposones para administrar los factores de reprogramación. Los métodos de inducción de células a la pluripotencia han evolucionado desde el uso de vectores retrovirales integradores9,vectores lentivirales excisables10,11 y métodos basados en transposones12 hasta vectores adenovirales no integradores13 y vectores basados en virus de Sendai14. La reprogramación basada en retrovirales y lentivirales, aunque eficiente, implica la integración de los factores de reprogramación en los cromosomas del huésped, causando mutaciones de inserción que tienen efectos imprevistos en las iPSC. Además, la reprogramación basada en virus impide la aplicación traslacional de iPSC. Se han explorado los sistemas basados en ARN15 y la entrega directa de proteínas16 para eliminar por completo los riesgos potenciales asociados con el uso de virus y transfecciones de ADN. Sin embargo, estos métodos han demostrado ser ineficientes.
En 2011, Okita et al. informaron una mejora en la eficiencia de la reprogramación por plásmidos episomales aumentados con la supresión de TP53 a través de shRNA. También reemplazaron cMYC con LMYC no transformador (MYC asociado al carcinoma de pulmón de células pequeñas) para mejorar la seguridad de las hiPSC. Estos plásmidos episomales expresan 5 factores de reprogramación: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC y shRNA para TP5317,18. Estos vectores se mantienen extracromosómicamente y se pierden de las células reprogramadas en el cultivo continuo, lo que hace que las líneas estén libres de transgenes dentro de 10-15 pasajes. La nucleofection es una forma especializada de electroporación que suministra ácidos nucleicos directamente al núcleo de las células huésped. Es un método eficiente para la entrega de los plásmidos de reprogramación en varios tipos de células. Los plásmidos episomales son rentables y compensan los altos costos de la nucleofección. Este método es eficiente y reproducible en condiciones optimizadas, produciendo iPSC estables a partir de una variedad de células somáticas. En este protocolo, describimos el método para la generación de iPSCs a partir de fibroblastos aislados del tejido fetal por nucleofección de plásmidos de reprogramación episomal. Aquí están los protocolos detallados para el aislamiento de fibroblastos de vellosidades coriónicas fetales, purificación de plásmidos, nucleofection, selección de colonias de la placa de reprogramación y establecimiento de iPSC estables.
Es esencial confirmar la presencia de rasgos de pluripotencia en las iPSC recién generadas. Esto incluye la demostración de factores relacionados con la pluripotencia (por ejemplo, expresión de fosfatasa alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherina; generalmente se muestra con ensayos de inmunofluorescencia o expresión génica), identificación de las tres capas germinales mediante ensayos de diferenciación in vitro para validar sus potenciales de diferenciación, cariotipo para determinar el contenido cromosómico, tipificación STR para establecer identidad con células madre, verificar la pérdida de genes exógenos, y ensayos in vivo más estrictos, como la formación de teratomas y la complementación tetraploide. Aquí describimos protocolos de caracterización de cariotipo, tinción de fosfatasa alcalina de células vivas, detección de biomarcadores relacionados con la pluripotencia por inmunofluorescencia, ensayos de diferenciación in vitro y método para demostrar pérdida de genes exógenos19.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generación de modelos celulares estables de tejido fetal citogenéticamente anormal es necesaria para perpetuar el fenotipo defectuoso. La ruta iPSC es el método más eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de propiedades defectuosas20.
Las células madre pluripotentes (PSC) muestran propiedades de autorrenovación y diferenciación en células especializadas que recuerdan a los embriones de escisión temprana21. Por lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo financiero para la investigación anterior fue proporcionado por la Academia de Educación Superior manipal. La caracterización de la línea se realizó parcialmente en el laboratorio de M.M. Panicker en NCBS. Agradecemos a Anand Diagnostic Laboratory por su ayuda con el cariotipo.
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
References
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