Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von integrationsfreien iPS-Zellen aus fetalen Gewebefibroblasten durch Abgabe episomaler Plasmide durch Nukleofektion, gefolgt von der Beschreibung von Methoden zur iPSC-Charakterisierung und neuronalen Differenzierung.

Abstract

Chromosomale Aneuploidien verursachen schwere angeborene Fehlbildungen, einschließlich Fehlbildungen des zentralen Nervensystems und fetalem Tod. Das pränatale genetische Screening ist rein diagnostisch und klärt den Krankheitsmechanismus nicht auf. Obwohl Zellen von aneuploiden Föten wertvolles biologisches Material sind, das die chromosomale Aneuploidie trägt, sind diese Zellen kurzlebig, was ihre Verwendung für nachgelagerte Forschungsexperimente einschränkt. Die Generierung von modellen für induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) ist eine effektive Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung aneuploider Merkmale. Sie erneuern sich selbst und differenzieren sich zu spezialisierten Zellen, die an die Embryonalentwicklung erinnern. Daher dienen iPS-Zellen als hervorragende Werkzeuge, um frühe Entwicklungsereignisse zu untersuchen. Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die mit einem ganz oder teilweise fehlenden X-Chromosom einhergeht. Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine, metabolische, autoimmune und kardiovaskuläre Störungen und neurokognitive Defekte. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von Fibroblasten aus TS (45XO) fetalem Gewebe, die Erzeugung von integrationsfreien TSiPS-Zellen durch Abgabe von episomalen Reprogrammierungsplasmiden durch Nukleofektion mit anschließender Charakterisierung. Die reprogrammierenden TSiPS-Zellen wurden zunächst durch lebendzellige alkalische Phosphatase-Färbung gescreent, gefolgt von umfangreichen Untersuchungen nach Pluripotenz-Biomarkern. Ausgewählte Kolonien wurden mechanisch seziert, mehrmals durchquert und stabile, sich selbst erneuernde Zellen für weitere Experimente verwendet. Die Zellen exprimierten Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, NANOG, SOX2, Zelloberflächenmarker SSEA 4 und TRA1-81, die typisch für pluripotente Stammzellen sind. Der ursprüngliche 45XO-Karyotyp wurde nach der Neuprogrammierung beibehalten. Die TSiPS-Zellen waren in der Lage, embryoide Körper zu bilden und sich in Zellen von Endoderm, Mesoderm und Ektoderm zu differenzieren, die linienspezifische Biomarker exprimieren ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Die exogenen episomalen Plasmide gingen spontan verloren und wurden nach Passage 15 in Zellen nicht nachgewiesen. Diese TSiPS-Zellen sind eine wertvolle zelluläre Ressource für die Modellierung defekter molekularer und zellulärer Neuroentwicklung, die neurokognitive Defizite im Zusammenhang mit dem Turner-Syndrom verursachen.

Introduction

Aneuploidien führen beim Menschen zu Geburtsfehlern/angeborenen Fehlbildungen und Schwangerschaftsverlust. ~ 50% -70% der Proben aus Schwangerschaftsverlusten zeigen zytogenetische Anomalien. Aneuploide Embryonen, die früh in der Schwangerschaft verloren gehen, können nicht einfach für experimentelle Analysen gewonnen werden, was die Notwendigkeit erhöht, andere Modelle zu entwickeln, die die menschliche Embryogenese genau repräsentieren. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die aus Zellen gewonnen wurden, bei denen genetische Störungen diagnostiziert wurden, wurden verwendet, um die repräsentativen genetischen Unregelmäßigkeiten und ihre Folgen für die fetale Entwicklung zu modellieren^1,2,3,4. Diese iPS-Zellen ähneln Epiblastenzellen des sich entwickelnden Embryos und können die frühen Ereignisse der Embryonenbildung rekapitulieren. Sie ermöglichen das Verständnis und die Charakterisierung des Entwicklungsprogramms von Zelllinien und Mustern in frühen Säugetierembryonen. iPS-Zellen, die zuvor aus Hautfibroblasten und Amniozyten aus pränatalen diagnostischen Tests von Aneuploidie-Syndromen wie Monosomie X (Turner-Syndrom), Trisomie 8 (Warkany-Syndrom 2), Trisomie 13 (Patau-Syndrom) und partieller Trisomie 11 abgeleitet wurden; 22 (Emanuel-Syndrom) haben wertvolle Erkenntnisse über gescheiterte Entwicklungen geliefert⁴.

Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die durch weibliche Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine und metabolische Störungen, ein erhöhtes Risiko für Autoimmunerkrankungen und eine Prädisposition für Herz-Kreislauf-Erkrankungen gekennzeichnet ist⁵. Obwohl es das einzige überlebensfähige Monosomie-Syndrom ist, ist es auch tödlich für den sich entwickelnden Embryo, der spontane Abtreibungen verursacht⁶. Überlebende Individuen mit TS zeigen einen Grad der Veränderung von X-chromosomalem Material in ihren Zellen. Karyotypen reichen vom vollständigen Verlust eines X-Chromosoms (45,XO) bis hin zu Mosaiken wie 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, das Vorhandensein von Ringchromosomen, das Vorhandensein von Y-chromosomalem Material usw.⁵.

Die Diagnose des Syndroms erfolgt im Allgemeinen durch Karyotypisierung von Blut von symptomatischen Personen und Chorionzottenbiopsie (CVS), um frühe Aneuploidie-Syndrome zu erkennen. Da Aneuploidie-Syndrome für ~ 30% der spontanen Abtreibungen verantwortlich sind, ist es Routine, das Produkt der Empfängnis (POC) nach einer spontanen Abtreibung zu karyotypisieren. Diese fetalen Zellen, einschließlich der Chorionzotten, die die zytogenetische Anomalie besitzen, und die daraus abgeleiteten iPS-Zellen bieten eine wertvolle Quelle für biologisches Material zur Untersuchung der Aneuploidie-Syndrome^4,6. TS iPS-Zellen wurden zuvor aus Amniozyten durch retrovirale Reprogrammierung⁴, Fibroblasten von Chorionzotten (erhalten durch pränatale Diagnostik) durch retrovirale Reprogrammierung⁶, aus mononukleären Blutzellen⁷ durch Sendai-Virus-Reprogrammierung und aus Hautfibroblasten von TS-Individuen durch lentivirale Reprogrammierung⁴ . Da das Hauptaugenmerk unseres Labors auf dem Verständnis von Entwicklungsstörungen liegt, haben wir TS iPSCs aus POC erzeugt, insbesondere die Chorionzottenkomponente einer spontanen Abtreibung⁸. Alle aus diesem fötalen Gewebe isolierten Zellen hatten einen 45XO-Karyotyp und ergaben iPS-Zellen mit dem gleichen Karyotyp. Diese iPS-Zellen sind einzigartig, da sie die ersten sind, die von einem abgetriebenen Fötus erzeugt werden und eine wertvolle Ressource zur Untersuchung von aneuploidiebedingten Schwangerschaftsfehlern darstellen. Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik der Erzeugung von iPS-Zellen aus dieser einzigartigen Zellquelle durch episomale Reprogrammierung.

Die frühen Methoden der iPSC-Generierung verwendeten virale Transduktion und Transposons, um die Reprogrammierungsfaktoren zu liefern. Methoden zur Induktion von Zellen zur Pluripotenz haben sich von der Integration retroviraler^{Vektoren 9,}erregbaren lentiviralen^{Vektoren 10,11} und Transposon-basierten Methoden¹² zu nicht-integrierenden adenoviralen^{Vektoren 13} und Sendai-Virus-basierten Vektoren¹⁴entwickelt. Retrovirale und lentivirale Reprogrammierung, obwohl effizient, beinhaltet die Integration der Reprogrammierungsfaktoren in die Wirtschromosomen, was zu Insertionsmutationen führt, die unvorhergesehene Auswirkungen in den iPS-Zellen haben. Darüber hinaus verhindert die virale Reprogrammierung die translationale Anwendung von iPS-Zellen. RNA-basierte Systeme¹⁵ und direkte Proteinabgabe¹⁶ wurden untersucht, um die potenziellen Risiken, die mit der Verwendung von Viren und DNA-Transfektionen verbunden sind, vollständig zu eliminieren. Diese Methoden haben sich jedoch als ineffizient erwiesen.

Im Jahr 2011 berichteten Okita et al. über eine verbesserte Effizienz der Reprogrammierung durch episomale Plasmide, die mit TP53-Unterdrückung über shRNA verstärkt wurden. Sie ersetzten cMYC auch durch nicht transformierendes LMYC (small cell lung carcinoma associated MYC), um die Sicherheit der hiPS-Zellen zu erhöhen. Diese episomalen Plasmide exprimieren 5 Reprogrammierungsfaktoren: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC und shRNA für TP53^17,18. Diese Vektoren werden extrachromosomal beibehalten und gehen bei kontinuierlicher Kultur von den reprogrammierten Zellen verloren, wodurch die Linien innerhalb von 10-15 Passagen transgenfrei werden. Die Nukleofektion ist eine spezialisierte Form der Elektroporation, die Nukleinsäuren direkt in den Kern der Wirtszellen abgibt. Es ist eine effiziente Methode zur Abgabe der reprogrammierenden Plasmide in verschiedene Zelltypen. Episomale Plasmide sind kostengünstig und kompensieren die hohen Kosten der Nukleofektion. Diese Methode ist effizient und reproduzierbar unter optimierten Bedingungen und liefert stabile iPS-Zellen aus einer Vielzahl von somatischen Zellen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode zur Erzeugung von iPS-Zellen aus Fibroblasten, die aus fetalem Gewebe durch Nukleofektion von episomalen Reprogrammierungsplasmiden isoliert wurden. Hier sind die detaillierten Protokolle für die Fibroblastenisolierung aus fetalen Chorionzotten, Plasmidreinigung, Nukleofektion, Pflücken von Kolonien von der Reprogrammierungsplatte und Etablierung stabiler iPS-Zellen.

Es ist wichtig, das Vorhandensein von Pluripotenzmerkmalen in den neu erzeugten iPS-Zellen zu bestätigen. Dazu gehören der Nachweis von pluripotenzbezogenen Faktoren (z. B. alkalische Phosphataseexpression, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-Cadherin; in der Regel mit Immunfluoreszenz- oder Genexpressionsassays gezeigt), die Identifizierung der drei Keimschichten durch In-vitro-Differenzierungstests zur Validierung ihres Differenzierungspotenzials, die Karyotypisierung zur Bestimmung des Chromosomengehalts, die STR-Typisierung zur Feststellung der Identität mit Elternzellen, die Überprüfung des Verlusts exogener Gene. und strengere In-vivo-Assays wie Teratombildung und tetraploide Komplementierung. Hier beschreiben wir Charakterisierungsprotokolle der Karyotypisierung, die alkalische Phosphatasefärbung lebender Zellen, den Nachweis von pluripotenzbezogenen Biomarkern durch Immunfluoreszenz, In-vitro-Differenzierungsassays und Methoden zum Nachweis des Verlusts exogener Gene¹⁹.

Protocol

FCV wurden vom Manipal Hospital, Bengaluru, unter der Genehmigung der Ethikkommission der Manipal Hospitals erhalten. HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung aller Puffer und Lösungen. 1. Isolierung von Fibroblasten aus fetalen Chorionzotten (FCV) Probenentnahme und Gewebedesintegration in kollagenase FCV unter sterilen Bedingungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sammeln …

Representative Results

Generierung von integrationsfreien iPS-Zellen aus einem spontan abgetriebenen Fötus mit 45XO-KaryotypWir isolierten Fibroblasten aus FCV mit einem Turner-Syndrom (TS)-spezifischen 45XO-Karyotyp und nukleofizierten sie mit episomalen Reprogrammierungsplasmiden, um TSiPS-Zellen zu erzeugen, die für die nachgeschaltete Modellierung des Syndroms, insbesondere der damit verbundenen neurologischen Defizite, verwendet werden können (Abbildung 1a& b). Für di…

Discussion

Die Erzeugung stabiler zellulärer Modelle zytogenetisch abnormalen fetalen Gewebes ist notwendig, um einen defekten Phänotyp aufrechtzuerhalten. Der iPSC-Weg ist die effektivste Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung defekter Eigenschaften²⁰.

Pluripotente Stammzellen (PSC) zeigen Eigenschaften der Selbsterneuerung und Differenzierung in spezialisierte Zellen, die an frühe Spaltungsembryonen erinnern²¹. Daher können PSCs als her…

Materials

0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	–	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays