Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Turners syndrom (45XO) Fosterceller för nedströms modellering av neurologiska underskott i samband med syndromet
Summary
Detta protokoll beskriver generering av integration gratis iPSCs från fetala vävnad fibroblaster genom leverans av episomal plasmider genom nukleofection följt av beskrivning av metoder som används för iPSC karakterisering och neuronal differentiering.
Abstract
Kromosomal aneuploidies orsaka allvarliga medfödda missbildningar inklusive centrala nervsystemet missbildningar och fetala död. Prenatala genetisk screening är rent diagnostisk och belyser inte sjukdom mekanism. Även om celler från aneuploida foster är värdefullt biologiskt material som bär kromosomal aneuploidy, är dessa celler kortlivade, vilket begränsar deras användning för nedströms forskningsexperiment. Generering av inducerade pluripotenta stamcellsmodeller (iPSC) är en effektiv metod för cellberedning för evig bevarande av aneuploidegenskaper. De är självförnyande och differentierar sig till specialiserade celler som påminner om embryonal utveckling. IPSCs fungerar således som utmärkta verktyg för att studera tidiga utvecklingshändelser. Turner syndrom (TS) är ett sällsynt tillstånd som är associerade med en helt eller delvis saknas X-kromosom. Syndromet kännetecknas av infertilitet, kort resning, endokrina, metabola, autoimmuna och kardiovaskulära störningar och neurokognitiva defekter. Följande protokoll beskriver isolering och odling av fibroblaster från TS (45XO) fetala vävnad, generering av integration gratis TSiPSCs genom leverans av episomal omprogrammering plasmider genom nukleofection följt av karakterisering. Omprogrammering TSiPSCs screenades ursprungligen av levande cell alkaliska fosfatas färgning följt av omfattande sondering för pluripotency biomarkörer. Utvalda kolonier dissekerades mekaniskt, passagedes flera gånger och stabila självförnyande celler användes för ytterligare experiment. Cellerna uttryckte pluripotency transkriptionsfaktorer OCT4, NANOG, SOX2, cellytan markörer SSEA 4 och TRA1-81 typiska för pluripotenta stamceller. Den ursprungliga 45XO karyotyp behölls efter omprogrammering. TSiPSCs kunde bilda embryoidkroppar och differentieras till celler av endoderm, mesoderm och ectoderm som uttrycker härstamningsspecifika biomarkörer ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Exogena episomal plasmids förlorades spontant och inte upptäckts efter passage 15 i celler. Dessa TSiPSCs är en värdefull cellulär resurs för modellering defekt molekylära och cellulära neuroutveckling orsakar neurokognitiva underskott är associerade med Turner syndrom.
Introduction
Aneuploidies leder till fosterskador/medfödda missbildningar och graviditet förlust hos människor. ~ 50%-70% av exemplaren från graviditetsförluster visar cytogenetiska avvikelser. Aneuploida embryon som förlorats tidigt i graviditeten kan inte lätt erhållas för experimentell analys som ökar behovet av att utveckla andra modeller som nära representerar human embryogenes. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som härrör från celler som diagnostiserats med genetiska störningar har använts för att modellera de representativa genetiska oegentligheterna och deras konsekvens på fostrets utveckling1,2,3,4. Dessa iPSCs liknar epiblastceller i det utvecklande embryot och kan rekapitulera de tidiga händelserna i embryobildning. De tillåter förståelse och karakterisering av utvecklingsprogrammet för cell härstamningar och mönstra i tidiga däggdjursembryon. IPSCs härrör tidigare från huden fibroblaster och amniocyter från prenatala diagnostiska tester av aneuploidy syndrom som monosomi X (Turner syndrom), trisomi 8 (Warkany syndrom 2), trisomi 13 (Patau syndrom) och partiell trisomi 11; 22 (Emanuel syndrom) har gett värdefulla insikter om misslyckad utveckling4.
Turner syndrom (TS) är ett sällsynt tillstånd som kännetecknas av kvinnlig infertilitet, kort resning, endokrina och metabola störningar, en ökad risk för autoimmun sjukdom och en predisposition för hjärt-kärlsjukdom5. Även om det är det enda överlevnadsbara monosomisyndromet är det också dödligt för det utvecklande embryot som orsakar spontana aborter6. Överlevande individer med TS närvarande med grader av förändring av X-kromosomal material i sina celler. Karyotyper varierar från fullständig förlust av en X-kromosom (45,XO) till mosaiker som 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, närvaron av ringkromosomer, närvaron av Y-kromosommaterialetc.
Diagnos av syndromet görs i allmänhet genom karyotypning blod av symptomatiska individer och chorionic villi provtagning (CVS) för att upptäcka tidiga aneuploidy syndrom. Eftersom aneuploidy syndrom står för ~ 30% av spontana aborter, är det rutin att karyotyp produkten av befruktning (POC) vid en spontan abort. Dessa fetala celler inklusive chorionic villi som har cytogenetiska onormala tillstånd och iPSCs som härrör från dem ger en värdefull källa till biologiskt material för att studera aneuploidy syndrom4,6. TS iPSCs har tidigare etablerats från amniocyter via retroviral omprogrammering4, fibroblaster av korioniska villi (erhållna genom prenatal diagnos) via retroviral omprogrammering6, från blodmononukleära celler7 via Sendai virus omprogrammering och från huden fibroblaster av TS-individer via lentiviral omprogrammering4 . Eftersom det primära fokuset för vårt labb är att förstå utvecklingsmisslyckande har vi genererat TS iPSCs från POC, särskilt den chorionic villi komponenten i en spontan abort8. Alla celler isolerade från denna fetala vävnad hade en 45XO karyotyp och gett iPSCs med samma karyotyp. Dessa iPSCs är unika eftersom de är de första som genereras från ett aborterat foster och ger en värdefull resurs för att studera aneuploidy relaterade graviditet misslyckanden. Den här artikeln innehåller en detaljerad metod för generering av iPSCs från denna unika cellkälla via episomal omprogrammering.
De tidiga metoderna för iPSC-generering använde viral transduktion och transposoner för att leverera omprogrammeringsfaktorerna. Metoder för att inducera celler till pluripotens har utvecklats från att använda integrera retrovirala vektorer9,excisable lentiviral vektorer10,11 och transposonbaserade metoder12 till icke-integrerande adenoviral vektorer13 och Sendai virusbaserade vektorer14. Retroviral och lentiviral baserade omprogrammering, även om effektiv, innebär integration av omprogrammeringsfaktorerna i värd kromosomer, orsakar insättning mutationer som har oförutsedda effekter i iPSCs. Dessutom förhindrar virusbaserad omprogrammering translationell tillämpning av iPSC. RNA-baserade system15 och direkt proteintillförsel16 har undersökts för att helt eliminera de potentiella riskerna i samband med användning av virus och DNA-transfektioner. Dessa metoder har dock visat sig ineffektiva.
Under 2011 rapporterade Okita et al. förbättrad effektivitet av omprogrammering av episomala plasmider förstärkta med TP53-dämpning via shRNA. De ersatte också cMYC med icke-transformerande LMYC (små cell lung carcinom associerade MYC) för att förbättra säkerheten för hiPSCs. Dessa episomala plasmider uttrycker 5 omprogrammeringsfaktorer: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC och shRNA för TP5317,18. Dessa vektorer underhålls extra-kromosomalt och förloras från de omprogrammerade cellerna på kontinuerlig kultur, vilket gör linjerna transgene-fria inom 10-15 passager. Nukleofection är en specialiserad form av elektroporation som levererar nukleinsyror direkt in i kärnan av värdceller. Det är en effektiv metod för leverans av omprogrammeringsplasmider till olika celltyper. Episomala plasmider är kostnadseffektiva och kompenserar de höga kostnaderna för nukleofection. Denna metod är effektiv och reproducerbar under optimerade förhållanden som ger stabila iPSCs från en mängd olika somatiska celler. I detta protokoll beskriver vi metoden för generering av iPSCs från fibroblaster isolerade från fetala vävnad genom nukleofection av episomal omprogrammering plasmider. Här är de detaljerade protokollen för fibroblast isolering från fetala chorionic villi, plasmid rening, nukleofection, plockning av kolonier från omprogrammering plattan och upprättandet av stabila iPSCs.
Det är viktigt att bekräfta förekomsten av pluripotency egenskaper i de nyligen genererade iPSCs. Detta inkluderar påvisande av pluripotensrelaterade faktorer (t.ex. alkaliska fosfatasuttryck, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; vanligtvis visas med immunofluorescens- eller genuttrycksanalyser), identifiering av de tre bakterielagren genom in vitro-differentieringsanalyser för att validera deras differentieringspotential, karyotypning för att bestämma kromosominnehåll, STR-skrivning för att fastställa identitet med överordnade celler, verifiera förlust av gener. och strängare in vivo-analyser såsom teratombildning och tetraploidkomplementering. Här beskriver vi karakteriseringsprotokoll av karyotypning, levande celler alkalisk fosfatasfärgning, detektion av pluripotensrelaterade biomarkörer genom immunofluorescens, in vitro differentieringsanalyser och metod för att visa förlust av exogena gener19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering av stabila cellulära modeller av cytogenetiskt onormal fetala vävnad är nödvändigt för att upprätthålla defekta fenotyp. IPSC-rutten är den mest effektiva metoden för cellberedning för evig bevarande av defekta egenskaper20.
Pluripotenta stamceller (PSC) visar egenskaper hos självförnyelse och differentiering i specialiserade celler som påminner om tidiga klyvningsembryon21. Därför kan PSCs fungera som utmärkta modelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ekonomiskt stöd till ovanstående forskning tillhandahölls av Manipal Academy of Higher Education. Karakterisering av linjen genomfördes delvis i laboratoriet för M.M Panicker vid NCBS. Vi tackar Anand Diagnostic Laboratory för hjälp med karyotypning.
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
References
- Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
- Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
- Biancotti, J. -. C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
- Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
- Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
- Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
- Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
- Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).
