Generation og kultur af lingualorganoider afledt af voksne musesmag stamceller
Summary
Protokollen præsenterer en metode til dyrkning og behandling af sproglige organoider afledt af smagstamceller isoleret fra den bageste smag papilla af voksne mus.
Abstract
Smagssansen medieres af smagsløg på tungen, som består af hurtigt fornyende smagsreceptorceller (TRCs). Denne fortsatte omsætning er drevet af lokale stamfaderceller og gør smagsfunktionen tilbøjelig til forstyrrelser af et væld af medicinske behandlinger, hvilket igen alvorligt påvirker livskvaliteten. Således er det vigtigt at studere denne proces i forbindelse med lægemiddelbehandling for at forstå, om og hvordan smags stamfaderfunktion og TRC-produktion påvirkes. I betragtning af de etiske bekymringer og begrænset tilgængelighed af human smag væv, musemodeller, som har en smag system svarende til mennesker, er almindeligt anvendt. Sammenlignet med in vivo-metoder, som er tidskrævende, dyre og ikke modtagelige for undersøgelser med høj gennemløb, kan murine lingual organoider gøre det muligt at køre eksperimenter hurtigt med mange replikationer og færre mus. Her er tidligere offentliggjorte protokoller blevet tilpasset, og en standardiseret metode til generering af smagsorganoider fra smag stamfaderceller isoleret fra den omkredslige papilla (CVP) af voksne mus præsenteres. Smag stamfaderceller i CVP express LGR5 og kan isoleres via EGFP fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) fra mus, der bærer en Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 allele. Sorterede celler er belagt på et matrix gel-baseret 3D-kultursystem og dyrkes i 12 dage. Organoider udvider sig i de første 6 dage af kulturperioden via spredning og går derefter ind i en differentieringsfase, hvor de genererer alle tre smagscelletyper sammen med ikke-smags epitelceller. Organoider kan høstes ved modning på dag 12 eller når som helst under vækstprocessen for RNA-udtryk og immunohistokemisk analyse. Standardisering af kulturmetoder til produktion af lingualorganoider fra voksne stamceller vil forbedre reproducerbarheden og fremme lingualorganoider som et kraftfuldt lægemiddelscreeningsværktøj i kampen for at hjælpe patienter, der oplever smagsdysfunktion.
Introduction
Hos gnavere er lingual smagsløg anbragt i fungiform papillae fordelt forreste, bilateral foliate papillae posteriorly, samt en enkelt circumvallate papilla (CVP) på den bageste midterlinje af tungen1. Hver smagsløg består af 50-100 kortvarige, hurtigt fornyende smag receptor celler (TRCs), som omfatter type I glial-lignende støtteceller, type II celler, der registrerer søde, bitter, og umami, og type III celler, der registrerer sur2,3,4. I musen CVP, LGR5+ stamceller langs basal lamina producere alle TRC typer samt ikke-smag epitelceller5. Ved fornyelse af smagslinjen specificeres LGR5-datterceller først som post-mitotiske smagsprækursorerceller (type IV-celler), der kommer ind i en smagsløg og er i stand til at differentiere sig i en af de tre TRC-typer6. Den hurtige omsætning af TRCs gør smagssystemet modtagelige for forstyrrelser af medicinske behandlinger, herunder stråling og visse lægemiddelbehandlinger7,8,9,10,11,12,13. Således er det afgørende at studere smagssystemet i forbindelse med smagsstamcelleregulering og TRC-differentiering for at forstå, hvordan man afbøder eller forhindrer smagsdysfunktion.
Mus er en traditionel model for in vivo-studier i smagsvidenskab, da de har et smagssystem organiseret på samme måde som mennesker14,15,16. Mus er dog ikke ideelle til undersøgelser med høj gennemløb, da de er dyre at vedligeholde og tidskrævende at arbejde med. For at overvinde dette er der i de senere år blevet udviklet in vitro organoidkulturmetoder. Smag organoider kan genereres fra indfødte CVP væv, en proces, hvor organoider bud off fra isolerede mus CVP epitel dyrkede ex vivo17. Disse organoider viser et flerlags epitel i overensstemmelse med in vivo smagssystemet. En mere effektiv måde at generere organoider, der ikke kræver ex vivo CVP-kultur, blev udviklet af Ren etal. i 201418. Tilpasning af metoder og kulturmedier, der først blev udviklet til at dyrke tarmorganoider, isolerede de enkelt Lgr5-GFP+ stamfaderceller fra musen CVP og belagt dem i matrix gel19. Disse enkelte celler genererede linguelle organoider, der formerer sig i løbet af de første 6 dage af kulturen, begynder at differentiere omkring dag 8, og ved udgangen af kulturperioden indeholder ikke-smag epitelceller og alle tre TRC typer18,20. Til dato er der offentliggjort flere undersøgelser, der anvender det sproglige organoidmodelsystem,17,18,20,21,22; Metoder og kulturbetingelser, der anvendes til at generere disse organoider, varierer dog på tværs af publikationer (supplerende tabel 1). Således er disse metoder blevet justeret og optimeret her for at præsentere en detaljeret standardiseret protokol for kulturen af lingual organoids afledt af LGR5+ forfædre af voksne mus CVP.
Lingual organoider giver en unik model til at studere de cellebiologiske processer, der driver smagscelleudvikling og fornyelse. Som anvendelser af lingual organoids udvide og flere laboratorier bevæger sig i retning af at udnytte in vitro organoid modeller, er det vigtigt, at området stræber efter at udvikle og vedtage standardiserede protokoller for at forbedre reproducerbarhed. Etablering lingual organoids som et standardværktøj inden for smagsvidenskab ville muliggøre høj gennemløb undersøgelser, der driller fra hinanden, hvordan enkelte stamceller generere differentierede celler i den voksne smag system. Derudover kan lingual organoids anvendes til hurtigt at screene lægemidler for potentielle virkninger på smag homøostase, som derefter kunne undersøges mere grundigt i dyremodeller. Denne tilgang vil i sidste ende øge indsatsen for at udtænke behandlinger, der forbedrer livskvaliteten for fremtidige lægemiddelmodtagere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rapporteret her er en effektiv og let repeterbar metode til dyrkning, vedligeholdelse og behandling lingual organoider stammer fra voksne mus smag stamceller. Det blev konstateret, at ved hjælp af tre CVPs fra 8 til 20-uger gamle Lgr5–EGFP mus er tilstrækkelig til at opnå ~ 10.000 GFP+ celler til eksperimentel brug, hvilket resulterer i 50 brønde forgyldt ved en tæthed på 200 celler pr godt i 48-brønd plader. Fjernelse af CVP skyttegrav epithelia optimeres ved at injicere lingual epitel med fri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Peter Dempsey og Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid og Tissue Modellering Shared Resource) for at give WNR konditionerede medier og værdifulde diskussioner. Vi takker også University of Colorado Cancer Center Cell Technologies og Flow Cytometry Shared Resources, især Dmitry Baturin, for celle sortering ekspertise. Dette arbejde blev finansieret af: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 og NIH/NCI R21 CA236480 til LAB og R21DC016131 og R21DC016131-02S1 til GD og F32 DC015958 til EJG.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. . The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients’ food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. . Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v., Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
