Yetişkin Fare Tadı Kök Hücrelerinden Elde Edilen Lingual Organoidlerin Üretimi ve Kültürü
Summary
Protokol, yetişkin farelerin arka tat papillasından izole edilmiş tat kök hücrelerinden elde edilen dil organoidlerini kültleme ve işleme için bir yöntem sunar.
Abstract
Tat alma duyusu, hızla yenilenen tat reseptör hücrelerinden (WC’ ler) oluşan dildeki tat tomurcukları ile aracılık eder. Bu sürekli ciro, yerel ata hücreleri tarafından desteklenmektedir ve tat fonksiyonunu çok sayıda tıbbi tedavi ile bozulmaya eğilimli hale getirir ve bu da yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler. Bu nedenle, bu sürecin ilaç tedavisi bağlamında incelenmesi, tat progenitör fonksiyonunun ve TRC üretiminin etkilenip etkilenmediğini ve nasıl etkilendiğini anlamak için hayati öneme sahiptir. Etik kaygılar ve insan tat dokusunun sınırlı kullanılabilirliği göz önüne alındığında, insanlara benzer bir tat sistemine sahip fare modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Zaman alıcı, pahalı ve yüksek verim çalışmalarına uygun olmayan in vivo yöntemlerle karşılaştırıldığında, murine lingual organoidler deneylerin birçok çoğaltma ve daha az fare ile hızlı bir şekilde çalıştırılmasını sağlayabilir. Burada, daha önce yayınlanan protokoller uyarlanmıştır ve yetişkin farelerin sirkülatör papillasından (CVP) izole edilmiş tat progenitör hücrelerinden tat organoidleri üretmek için standartlaştırılmış bir yöntem sunulmuştur. CVP ekspres LGR5’teki progenitör hücreleri tadın ve LGR5EGFP-IRES-CreERT2 alel taşıyan farelerden EGFP floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) ile izole edilebilir. Sıralanmış hücreler matris jel tabanlı bir 3D kültür sistemi üzerine kaplanır ve 12 gün boyunca kültürlenir. Organoidler kültür döneminin ilk 6 günü çoğalma yoluyla genişler ve daha sonra tatsız epitel hücreleri ile birlikte üç tat hücresi tipini de ürettikleri bir farklılaşma evresi girerler. Organoidler, RNA ekspresyasyonu ve immünohistokimyasal analiz için büyüme sürecinde 12. Yetişkin kök hücrelerden lingual organoid üretimi için kültür yöntemlerinin standartlaştırılması, tekrarlanabilirliği artıracak ve dilsel organoidleri tat işlev bozukluğu yaşayan hastalara yardımcı olmak için mücadelede güçlü bir ilaç tarama aracı olarak ilerletecektir.
Introduction
Kemirgenlerde, dil tat tomurcukları, ön, bilateral tay papilla posteriorly dağıtılan mantar biçimi papillaların yanı sıra dilin posterodorsal orta hattında tek bir circumvallate papilla (CVP) ile barındırılır1. Her tat tostu, tip I glial benzeri destek hücreleri, tatlı, acı ve umamiyi algılayan tip II hücreleri ve ekşi2, 3,4’üalgılayan tip III hücrelerini içeren 50-100 kısa ömürlü, hızla yenilenen tat reseptör hücrelerinden (WC) oluşur. Fare CVP’sinde, BAZAL lamina boyunca LGR5+ kök hücreler tüm TRC tiplerini ve tatsız epitel hücrelerini üretir5. Tat soyunun yenilenmesinde, LGR5 kız hücreleri ilk olarak bir tat tokasına giren ve üç TRC tip6’danherhangi birine farklılaşabilen mitotik tat öncül hücreleri (tip IV hücreleri) olarak belirtilir. TRC’lerin hızlı cirosu, radyasyon ve bazı ilaç tedavileri 7 , 8 , 9 , 10,11,12,13dahil olmak üzere tıbbi tedavilerle tat sistemini bozulmaya açık hale getirir. Bu nedenle, tat kök hücre regülasyonu ve TRC farklılaşması bağlamında tat sistemini incelemek, tat disfonksiyonunun nasıl azaltılacağını veya önlenebileceğini anlamak için hayati öneme sahiptir.
Fareler, insanlara benzer şekilde düzenlenmiş bir tat sistemine sahip oldukları için tat biliminde in vivo çalışmalar için geleneksel bir modeldir14,15,16. Bununla birlikte, fareler yüksek verim çalışmaları için ideal değildir, çünkü bakımı pahalıdır ve çalışmak için zaman alıcıdır. Bunun üstesinden gelmek için son yıllarda in vitro organoid kültürü yöntemleri geliştirilmiştir. Tat organoidleri, organoidlerin izole fare CVP epitel kültürlü ex vivo17’dentomurcukladığı bir işlem olan yerel CVP dokusundan üretilebilir. Bu organoidler in vivo tat sistemi ile uyumlu çok katmanlı bir epitel gösterir. Ex vivo CVP kültürü gerektirmeyen organoidleri üretmenin daha verimli bir yolu Ren veark. İlk olarak bağırsak organoidlerini büyütmek için geliştirilen yöntemleri ve kültür medyasını uyarlayarak, fare CVP’sinden tek lgr5-GFP+ progenitör hücreleri izole ettiler ve matris jel19ile kapladılar. Bu tek hücreler, kültürün ilk 6 günü boyunca çoğalan,8. Bugüne kadar lingual organoid model sistemini kullanan birden fazla çalışma yayınlanmıştır17,18,20,21,22; ancak, bu organoidleri oluşturmak için kullanılan yöntemler ve kültür koşulları yayınlar arasında farklılık gösterir (Tamamlayıcı Tablo 1). Bu nedenle, bu yöntemler, yetişkin fare CVP’nin LGR5+ atalarından türetilen lingual organoidlerin kültürü için ayrıntılı bir standartlaştırılmış protokol sunmak için burada ayarlanmış ve optimize edilmiştir.
Lingual organoidler, tat hücresi gelişimini ve yenilenmesini sağlayan hücre biyolojik süreçlerini incelemek için benzersiz bir model sağlar. Lingual organoidlerin uygulamaları genişledikçe ve daha fazla laboratuvar in vitro organoid modellerini kullanmaya doğru ilerledikçe, alanın tekrarlanabilirliği artırmak için standartlaştırılmış protokoller geliştirmeye ve benimsemeye çaba göstermesi önemlidir. Dil organoidlerinin tat bilimi içinde standart bir araç olarak kurulması, tek kök hücrelerin yetişkin tat sisteminin farklılaştırılmış hücrelerini nasıl ürettiğini birbirinden ayıran yüksek verim çalışmalarına olanak sağlayacaktır. Ek olarak, lingual organoidler, tat homeostazı üzerindeki potansiyel etkiler için ilaçları hızlı bir şekilde taramak için kullanılabilir ve daha sonra hayvan modellerinde daha ayrıntılı olarak araştırılabilir. Bu yaklaşım nihayetinde gelecekteki ilaç alıcıları için yaşam kalitesini artıran tedaviler tasarlama çabalarını artıracaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bildirilen, yetişkin fare tadı kök hücrelerinden elde edilen lingual organoidleri kültleme, sürdürme ve işleme için etkili ve kolayca tekrarlanabilir bir yöntemdir. 8 ila 20 haftalık Lgr5–EGFP farelerinin üç CVP kullanmanın deneysel kullanım için ~ 10.000 GFP+ hücre elde etmek için yeterli olduğu ve 48 kuyu plakalarında kuyu başına 200 hücre yoğunluğunda 50 kuyu ile sonuçlandığını buldu. CVP hendek epitelinin çıkarılması, lingual epitelin taze yapılmış Dispa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, WNR şartlı medya ve değerli tartışmalar sağladıkları için Dr. Peter Dempsey ve Monica Brown’a (Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü Organoid ve Doku Modelleme Paylaşılan Kaynağı) teşekkür eder. Ayrıca Colorado Üniversitesi Kanser Merkezi Hücre Teknolojileri ve Akış Sitometrisi Paylaşılan Kaynaklarına, özellikle Dmitry Baturin’e hücre sıralama uzmanlığı için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma şu şekilde finanse edildi: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 ve NIH/NCI R21 CA236480’den LAB’ye ve R21DC016131 ve R21DC016131-02S1’den DG’ye ve F32 DC015958’den EJG’ye.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. . The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients’ food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. . Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v., Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
