Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen
Summary
Das Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Verarbeitung von lingualen Organoiden vor, die aus Geschmacksstammzellen gewonnen werden, die aus der hinteren Geschmackspapille erwachsener Mäuse isoliert wurden.
Abstract
Der Geschmackssinn wird durch Geschmacksknospen auf der Zunge vermittelt, die sich aus sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs) zusammensetzen. Dieser kontinuierliche Umsatz wird von lokalen Vorläuferzellen angetrieben und macht die Geschmacksfunktion anfällig für Störungen durch eine Vielzahl von medizinischen Behandlungen, was wiederum die Lebensqualität stark beeinträchtigt. Daher ist die Untersuchung dieses Prozesses im Kontext der medikamentösen Behandlung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, ob und wie die Funktion des Geschmacksvorläufers und die TRC-Produktion beeinflusst werden. Angesichts der ethischen Bedenken und der begrenzten Verfügbarkeit von menschlichem Geschmacksgewebe werden häufig Mausmodelle verwendet, die ein ähnliches Geschmackssystem wie der Mensch haben. Im Vergleich zu In-vivo-Methoden, die zeitaufwendig, teuer und für Hochdurchsatzstudien nicht nutzbar sind, können murine linguale Organoide experimente mit vielen Replikaten und weniger Mäusen schnell durchführen. Hier wurden zuvor veröffentlichte Protokolle angepasst und eine standardisierte Methode zur Erzeugung von Geschmacksorganoiden aus Geschmacksvorläuferzellen vorgestellt, die aus der Circumvallat-Papille (CVP) erwachsener Mäuse isoliert wurden. Geschmacksvorläuferzellen im CVP exprimieren LGR5 und können mittels EGFP-Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) von Mäusen isoliert werden, die ein Lgr5EGFP-IRES-CreERT2-Allel tragen. Sortierte Zellen werden auf ein Matrix-Gel-basiertes 3D-Kultursystem auf plattiert und 12 Tage lang kultiviert. Organoide dehnen sich für die ersten 6 Tage der Kulturperiode durch Proliferation aus und treten dann in eine Differenzierungsphase ein, in der sie alle drei Geschmackszelltypen zusammen mit Nicht-Geschmacksepithelzellen erzeugen. Organoide können bei der Reifung am Tag 12 oder jederzeit während des Wachstumsprozesses für die RNA-Expression und immunhistochemische Analyse entnommen werden. Die Standardisierung von Kulturmethoden zur Herstellung von lingualen Organoiden aus adulten Stammzellen wird die Reproduzierbarkeit verbessern und linguale Organoide als leistungsfähiges Arzneimittel-Screening-Werkzeug im Kampf gegen Patienten mit Geschmacksstörungen fördern.
Introduction
Bei Nagetieren sind linguale Geschmacksknospen in fungiformen Papillen untergebracht, die anterior verteilt sind, bilaterale Blattpapillen nach dem Hinterteil sowie eine einzelne zirkumvallate Papille (CVP) an der posterodorsalen Mittellinie der Zunge1. Jede Geschmacksknospen besteht aus 50-100 kurzlebigen, sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs), zu denen gliaartige Unterstützungszellen vom Typ I, Zellen vom Typ II, die süße, bittere und Umami erkennen, und Typ III-Zellen, die saure2,3,4erkennen , umfassen. Im CVP der Maus produzieren LGR5+ Stammzellen entlang der Basallamina alle TRC-Typen sowie Nicht-Geschmacksepithelzellen5. Bei der Erneuerung der Geschmackslinie werden LGR5-Tochterzellen zunächst als postmiotische Geschmacksvorläuferzellen (Typ IV-Zellen) spezifiziert, die in eine Geschmacksknospen eintreten und in der Lage sind, sich in einen der drei TRC-Typen6 zudifferenzieren. Der schnelle Umsatz von TRCs macht das Geschmackssystem anfällig für Störungen durch medizinische Behandlungen, einschließlich Bestrahlung und bestimmter medikamentöser Therapien7,8,9,10,11,12,13. Daher ist die Untersuchung des Geschmackssystems im Kontext der Regulierung von Geschmacksstammzellen und der TRC-Differenzierung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie Geschmacksstörungen gemildert oder verhindert werden können.
Mäuse sind ein traditionelles Modell für In-vivo-Studien in der Geschmackswissenschaft, da sie ein Geschmackssystem haben, das ähnlich wie Menschen organisiert ist14,15,16. Mäuse sind jedoch nicht ideal für Studien mit hohem Durchsatz, da sie teuer in der Wartung und zeitaufwendig in der Arbeit sind. Um dies zu überwinden, wurden in den letzten Jahren in vitro Organoidkulturmethoden entwickelt. Geschmacksorganoide können aus nativem CVP-Gewebe erzeugt werden, einem Prozess, bei dem Organoide aus isoliertem Maus-CVP-Epithel abknabknabken, das ex vivo17kultiviert wird. Diese Organoide zeigen ein mehrschichtiges Epithel, das mit dem In-vivo-Geschmackssystem übereinstimmt. Ein effizienterer Weg zur Erzeugung von Organoiden, die keine Ex-vivo-CVP-Kultur erfordern, wurde von Ren etal. im Jahr 201418entwickelt. Sie adaptierten Methoden und Nährmedien, die zuerst entwickelt wurden, um Darmorganoide zu züchten, isolierten einzelne Lgr5-GFP+ Vorläuferzellen aus Maus-CVP und plattierten sie mit Matrixgel19. Diese einzelnen Zellen erzeugten linguale Organoide, die sich während der ersten 6 Tage der Kultur vermehren, beginnen sich um Tag 8 zu differenzieren und enthalten am Ende der Kulturperiode nicht schmeckende Epithelzellen und alle drei TRC-Typen18,20. Bis heute wurden mehrere Studien veröffentlicht, die das linguale Organoidmodellsystem verwenden17,18,20,21,22; Die Methoden und Kulturbedingungen, die zur Erzeugung dieser Organoide verwendet werden, variieren jedoch je nach Veröffentlichung (Ergänzende Tabelle 1). Daher wurden diese Methoden hier angepasst und optimiert, um ein detailliertes standardisiertes Protokoll für die Kultur von lingualen Organoiden zu präsentieren, die von LGR5+ Vorläufern der adulten Maus CVP abgeleitet sind.
Linguale Organoide bieten ein einzigartiges Modell für die Untersuchung der zellbiologischen Prozesse, die die Entwicklung und Erneuerung von Geschmackszellen vorantreiben. Da sich die Anwendungen von lingualen Organoiden ausweiten und immer mehr Labore sich der Verwendung von In-vitro-Organoidmodellen zuwenden, ist es wichtig, dass das Feld bestrebt ist, standardisierte Protokolle zu entwickeln und einzuführen, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Die Etablierung von lingualen Organoiden als Standardwerkzeug in der Geschmackswissenschaft würde Hochdurchsatzstudien ermöglichen, die auseinandernehmen, wie einzelne Stammzellen die differenzierten Zellen des adulten Geschmackssystems erzeugen. Darüber hinaus könnten linguale Organoide eingesetzt werden, um Medikamente schnell auf mögliche Auswirkungen auf die Geschmacksöostase zu untersuchen, die dann in Tiermodellen gründlicher untersucht werden könnten. Dieser Ansatz wird letztendlich die Bemühungen verstärken, Therapien zu entwickeln, die die Lebensqualität zukünftiger Arzneimittelempfänger verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird eine effiziente und leicht wiederholbare Methode zur Kultivierung, Aufrechterhaltung und Verarbeitung von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen berichtet. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von drei CVPs von 8 bis 20 Wochen alten Lgr5 -EGFP-Mäusen ausreicht, um ~ 10.000 GFP+ -Zellen für den experimentellen Einsatz zu erhalten, was zu 50 Wells mit einer Dichte von 200 Zellen pro Well in 48-Well-Platten führt. Die Entfernung von CVP-Grabenepithelien wird optimie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Peter Dempsey und Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) für die Bereitstellung von WNR-konditionierten Medien und wertvollen Diskussionen. Wir danken auch dem University of Colorado Cancer Center Cell Technologies und Flow Cytometry Shared Resources, insbesondere Dmitry Baturin, für die Expertise in der Zellsortierung. Diese Arbeit wurde finanziert durch: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 und NIH/NCI R21 CA236480 an LAB und R21DC016131 und R21DC016131-02S1 an DG und F32 DC015958 an EJG.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
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