Génération et culture d’organoïdes linguals dérivés de cellules souches du goût de souris adultes
Summary
Le protocole présente une méthode de culture et de traitement des organoïdes linguaux dérivés de cellules souches gustatives isolées de la papille gustative postérieure de souris adultes.
Abstract
Le sens du goût est médié par les papilles gustatives sur la langue, qui sont composées de cellules réceptrices du goût (CRT) qui se renouvellent rapidement. Ce renouvellement continu est alimenté par des cellules progénigènes locales et rend la fonction gustative sujette à la perturbation par une multitude de traitements médicaux, ce qui à son tour affecte gravement la qualité de vie. Ainsi, l’étude de ce processus dans le contexte du traitement médicamenteux est essentielle pour comprendre si et comment la fonction progéniteur du goût et la production de CCR sont affectées. Compte tenu des préoccupations éthiques et de la disponibilité limitée des tissus du goût humain, les modèles murins, qui ont un système gustatif similaire à celui des humains, sont couramment utilisés. Par rapport aux méthodes in vivo, qui prennent beaucoup de temps, sont coûteuses et ne se prêtent pas à des études à haut débit, les organoïdes linguaux murins peuvent permettre d’exécuter rapidement des expériences avec de nombreux répliquants et moins de souris. Ici, des protocoles précédemment publiés ont été adaptés et une méthode standardisée pour générer des organoïdes du goût à partir de cellules progénitres du goût isolées de la papille circumvallate (CVP) de souris adultes est présentée. Les cellules progénitaires du CVP expriment LGR5 et peuvent être isolées via le tri cellulaire activé par fluorescence EGFP (FACS) de souris porteuses d’un allèleLgr5 EGFP-IRES-CreERT2. Les cellules triées sont plaquées sur un système de culture 3D à base de gel matriciel et cultivées pendant 12 jours. Les organoïdes se développent pendant les 6 premiers jours de la période de culture par prolifération, puis entrent dans une phase de différenciation, au cours de laquelle ils génèrent les trois types de cellules gustatives ainsi que des cellules épithéliales sans goût. Les organoïdes peuvent être prélevés à maturation au jour 12 ou à tout moment pendant le processus de croissance pour l’expression de l’ARN et l’analyse immunohistochimique. La normalisation des méthodes de culture pour la production d’organoïdes linguaux à partir de cellules souches adultes améliorera la reproductibilité et fera progresser les organoïdes linguaux en tant qu’outil puissant de dépistage des médicaments dans la lutte contre les patients souffrant de dysfonctionnement du goût.
Introduction
Chez les rongeurs, les papilles gustatives linguales sont logées dans des papilles fongiformes réparties antérieurement, des papilles foliées bilatérales postérieures, ainsi que dans une papille circumvallate unique (CVP) à la ligne médiane postodorale de la langue1. Chaque papille gustative est composée de 50 à 100 cellules réceptrices du goût (CRT) à courte durée de vie et à renouvellement rapide, qui comprennent des cellules de soutien de type I gliales, des cellules de type II qui détectent les cellules douces, amères et umami, et des cellules de type III qui détectent les cellulesacides 2,3,4. Chez la souris CVP, les cellules souches LGR5+ le long de la lame basale produisent tous les types de TRC ainsi que des cellules épithéliales sans goût5. Lors du renouvellement de la lignée gustative, les cellules filles LGR5 sont d’abord spécifiées comme des cellules précurseurs du goût post-mitotique (cellules de type IV) qui pénètrent dans une papille gustative et sont capables de se différencier dans l’un des trois types de TRC6. Le renouvellement rapide des CT rend le système gustatif sensible à la perturbation par les traitements médicaux, y compris les radiations et certaines pharmacothérapies7,8,9,10,11,12,13. Ainsi, l’étude du système gustatif dans le contexte de la régulation des cellules souches du goût et de la différenciation de la CVR est essentielle pour comprendre comment atténuer ou prévenir le dysfonctionnement du goût.
Les souris sont un modèle traditionnel pour les études in vivo en science du goût car elles ont un système gustatif organisé de la même manière que les humains14,15,16. Cependant, les souris ne sont pas idéales pour les études à haut débit, car elles sont coûteuses à entretenir et prennent beaucoup de temps à travailler. Pour surmonter ce problème, des méthodes de culture organoïde in vitro ont été développées ces dernières années. Les organoïdes gustatifs peuvent être générés à partir de tissu CVP natif, un processus dans lequel les organoïdes bourgeonnent à partir de l’épithélium CVP isolé de souris cultivé ex vivo17. Ces organoïdes présentent un épithélium multicouche compatible avec le système gustatif in vivo. Un moyen plus efficace de générer des organoïdes qui ne nécessitent pas de culture ex vivo de CVP a été développé par Ren etal. en 201418. Adaptant les méthodes et les milieux de culture d’abord développés pour développer des organoïdes intestinaux, ils ont isolé des cellules progéniatrices Lgr5-GFP+ uniques de souris CVP et les ont plaquées dans un gel matriciel19. Ces cellules uniques ont généré des organoïdes linguaux qui prolifèrent au cours des 6 premiers jours de culture, commencent à se différencier vers le jour 8 et, à la fin de la période de culture, contiennent des cellules épithéliales sans goût et les trois types de CCR18,20. À ce jour, de multiples études utilisant le système de modèle organoïde lingual ont été publiées17,18,20,21,22; toutefois, les méthodes et les conditions de culture utilisées pour générer ces organoïdes varient d’une publication à l’autre(tableau supplémentaire 1). Ainsi, ces méthodes ont été ajustées et optimisées ici pour présenter un protocole standardisé détaillé pour la culture d’organoïdes linguaux dérivés de LGR5+ progéniteurs de CVP de souris adultes.
Les organoïdes linguaux fournissent un modèle unique pour l’étude des processus biologiques cellulaires qui stimulent le développement et le renouvellement des cellules gustatives. Alors que les applications des organoïdes linguaux se développent et que de plus en plus de laboratoires s’orientent vers l’utilisation de modèles organoïdes in vitro, il est important que le domaine s’efforce de développer et d’adopter des protocoles standardisés pour améliorer la reproductibilité. L’établissement des organoïdes linguaux en tant qu’outil standard dans la science du goût permettrait des études à haut débit qui démêlent comment les cellules souches uniques génèrent les cellules différenciées du système gustatif adulte. De plus, des organoïdes linguaux pourraient être utilisés pour dépister rapidement les médicaments pour les impacts potentiels sur l’homéostasie du goût, qui pourraient ensuite être étudiés plus en profondeur dans des modèles animaux. En fin de compte, cette approche renforcera les efforts visant à concevoir des thérapies qui améliorent la qualité de vie des futurs receveurs de médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est rapporté ici une méthode efficace et facilement reproductible pour la culture, le maintien et le traitement des organoïdes linguaux dérivés de cellules souches de goût de souris adultes. Il a été constaté que l’utilisation de trois CV de souris Lgr5–EGFP âgées de 8 à 20 semaines est suffisante pour obtenir environ 10 000 cellules GFP+ à usage expérimental, ce qui donne 50 puits plaqués à une densité de 200 cellules par puits dans des plaques de 48 puits. L’élimination de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Peter Dempsey et Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) pour avoir fourni des médias conditionnés WNR et des discussions précieuses. Nous remercions également le Centre de cancérologie de l’Université du Colorado Cell Technologies et Flow Cytometry Shared Resources, en particulier Dmitry Baturin, pour son expertise en tri cellulaire. Ce travail a été financé par : NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, et NIH/NCI R21 CA236480 à LAB, et R21DC016131 et R21DC016131-02S1 à DG, et F32 DC015958 à EJG.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
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