Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco do Gosto de Rato Adulto
Summary
O protocolo apresenta um método para cultivo e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de sabor isoladas da papila de sabor posterior de camundongos adultos.
Abstract
A sensação de paladar é mediada por papilas gustativas na língua, que são compostas de células receptoras de sabor (TRCs) que renovam rapidamente. Essa rotatividade contínua é alimentada por células progenitoras locais e torna a função de paladar propensa à interrupção por uma infinidade de tratamentos médicos, o que, por sua vez, impacta severamente a qualidade de vida. Assim, estudar esse processo no contexto do tratamento medicamentoso é vital para entender se e como a função progenitora do sabor e a produção de TRC são afetadas. Dadas as preocupações éticas e a limitada disponibilidade do tecido de sabor humano, os modelos de camundongos, que têm um sistema de sabor semelhante aos humanos, são comumente usados. Em comparação com os métodos in vivo, que são demorados, caros e não favoráveis a estudos de alto rendimento, organoides linguais murinos podem permitir que experimentos sejam executados rapidamente com muitas réplicas e menos camundongos. Aqui, protocolos publicados anteriormente foram adaptados e um método padronizado para gerar organoides de paladar a partir de células progenitoras de sabor isoladas da papila circunvallada (CVP) de camundongos adultos é apresentado. Células progenitoras de sabor no LGR5 expresso CVP e podem ser isoladas através da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de camundongos portadores de um alelo Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. As células classificadas são banhadas em um sistema de cultura 3D baseado em gel matricial e cultivadas por 12 dias. Os organoides se expandem durante os primeiros 6 dias do período cultural por meio da proliferação e, em seguida, entram em uma fase de diferenciação, durante a qual geram todos os três tipos de células de paladar, juntamente com células epiteliais sem gosto. Os organoides podem ser colhidos após o amadurecimento no dia 12 ou a qualquer momento durante o processo de crescimento para expressão de RNA e análise imunohistoquímica. Padronizar métodos culturais para a produção de organoides linguais a partir de células-tronco adultas melhorará a reprodutibilidade e avançará organoides linguais como uma poderosa ferramenta de triagem de medicamentos na luta para ajudar pacientes que experimentam disfunção do sabor.
Introduction
Em roedores, as papilas gustativas linguais são alojadas em papilas fungiformes distribuídas anteriormente, papilas foliadas bilaterais posteriormente, bem como uma única papila circunvallada (CVP) na linha média posterodorsal da língua1. Cada paladar é composto por células receptoras de sabor de 50-100 de curta duração, que renovam rapidamente as células receptoras de sabor (TRCs), que incluem células de suporte tipo I, células tipo II que detectam células doces, amargas e umami, e células tipo III que detectam células azedas2,3,4. No mouse CVP, as células-tronco LGR5+ ao longo da lamina basal produzem todos os tipos de TRC, bem como células epiteliais não saborosas5. Ao renovar a linhagem de sabor, as células filhas LGR5 são primeiramente especificadas como células precursoras do sabor pós-mitótico (células tipo IV) que entram em uma papila gustativa e são capazes de se diferenciar em qualquer um dos três tipos TRC6. A rápida rotatividade dos TRCs torna o sistema de paladar suscetível à interrupção por tratamentos médicos, incluindo radiação e certas terapias medicamentosas7,8,9,10,11,12,13. Assim, estudar o sistema de paladar no contexto da regulação de células-tronco do sabor e da diferenciação de TRC é vital para entender como mitigar ou prevenir a disfunção do sabor.
Os camundongos são um modelo tradicional para estudos in vivo em ciência do sabor, uma vez que possuem um sistema de sabor organizado de forma semelhante aos humanos14,15,16. No entanto, os camundongos não são ideais para estudos de alto rendimento, pois são caros de manter e demorados para trabalhar. Para superar isso, métodos in vitro de cultura organoide têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Organoides de paladar podem ser gerados a partir do tecido CVP nativo, um processo no qual organoides brotam do camundongo isolado CVP epitélio cultivado ex vivo17. Estes organoides exibem um epitélio multicamadas consistente com o sistema de sabor in vivo. Uma forma mais eficiente de gerar organoides que não requerem a cultura ex vivo CVP foi desenvolvida pela Ren et al. em 201418. Adaptando métodos e meios de cultura desenvolvidos pela primeira vez para cultivar organoides intestinais, isolaram células lgr5-GFP+ progenitores únicas do mouse CVP e as banhavam em gel de matriz19. Essas células únicas geraram organoides linguais que se proliferam durante os primeiros 6 dias de cultura, começam a se diferenciar por volta do dia 8, e ao final do período cultural contêm células epiteliais sem gosto e todos os três tipos TRC18,20. Até o momento, foram publicados múltiplos estudos utilizando o sistema de modelo organoide lingual17,18,20,21,22; no entanto, os métodos e condições de cultura utilizados para gerar esses organoides variam entre as publicações (Tabela Suplementar 1). Assim, esses métodos foram ajustados e otimizados aqui para apresentar um protocolo padronizado detalhado para a cultura de organoides linguais derivados do LGR5+ progenitores do mouse adulto CVP.
Organoides linguais fornecem um modelo único para estudar os processos biológicos celulares que impulsionam o desenvolvimento e renovação das células do paladar. À medida que as aplicações dos organoides linguais se expandem e mais laboratórios se movem para utilizar modelos organoides in vitro, é importante que o campo se esforce para desenvolver e adotar protocolos padronizados para melhorar a reprodutibilidade. Estabelecer organoides linguais como uma ferramenta padrão dentro da ciência do sabor permitiria estudos de alto rendimento que provocam como células-tronco únicas geram as células-tronco diferenciadas do sistema de paladar adulto. Além disso, organoides linguais poderiam ser empregados para rastrear rapidamente drogas para potenciais impactos na homeostase do sabor, que poderia então ser investigada mais detalhadamente em modelos animais. Esta abordagem, em última análise, aumentará os esforços para criar terapias que melhorem a qualidade de vida dos futuros receptores de medicamentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Relatado aqui é um método eficiente e facilmente repetitivo para a cultura, manutenção e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de gosto de camundongos adultos. Verificou-se que o uso de três CVPs de camundongos Lgr5 de 8 a 20 semanas de idade–EGFP é suficiente para obter ~10.000 células GFP+ para uso experimental, resultando em 50 poços banhados a uma densidade de 200 células por poço em placas de 48 poços. A remoção da epitélio da trincheira CVP é otimizada …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peter Dempsey e Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) por fornecer mídia condicionada wnr e discussões valiosas. Agradecemos também à University of Colorado Cancer Center Cell Technologies and Flow Cytometry Shared Resources, especialmente Dmitry Baturin, pela experiência em triagem celular. Este trabalho foi financiado por: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 e NIH/NCI R21 CA236480 para LAB, e R21DC016131 e R21DC016131-02S1 para DG, e F32 DC015958 para EJG.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
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