הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.
חוש הטעם מתווך על ידי בלוטות טעם על הלשון, אשר מורכבים תאים קולטן טעם מתחדש במהירות (TRCs). מחזור מתמשך זה מופעל על ידי תאי אבות מקומיים והופך את תפקוד הטעם נוטה לשיבוש על ידי שפע של טיפולים רפואיים, אשר בתורו משפיע קשות על איכות החיים. לכן, לימוד תהליך זה בהקשר של טיפול תרופתי חיוני כדי להבין אם וכיצד תפקוד אבות הטעם וייצור TRC מושפעים. בהתחשב בדאגות האתיות ובזמינות המוגבלת של רקמת הטעם האנושית, מודלים של עכברים, שיש להם מערכת טעם דומה לבני אדם, נמצאים בשימוש נפוץ. בהשוואה לשיטות ויוו, שגוזלות זמן רב, יקרות, ולא נוחות למחקרי תפוקה גבוהים, אורגנוידים לשוניים של מורין יכולים לאפשר ניסויים להתנהל במהירות עם שכפולים רבים ופחות עכברים. כאן, פרוטוקולים שפורסמו בעבר הותאמו וגישה שיטה סטנדרטית ליצירת אורגנוידים של טעם מתאי אבות טעם המבודדים מהפאפילה המקיפה (CVP) של עכברים בוגרים. טעם תאי אבות ב- CVP אקספרס LGR5 וניתן לבודדם באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מעכברים הנושאים אלל Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. תאים ממוינים מצופים במערכת תרבית תלת-ממדית מבוססת ג’ל מטריצה ומתרבתים במשך 12 יום. Organoids להרחיב במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות באמצעות התפשטות ולאחר מכן להיכנס לשלב בידול, שבמהלכו הם מייצרים את כל שלושת סוגי תאי הטעם יחד עם תאים אפיתל שאינם טעם. אורגנוידים ניתן לקצור עם ההתבגרות ביום 12 או בכל עת במהלך תהליך הצמיחה עבור ביטוי RNA וניתוח אימונוהיסטוכימי. סטנדרטיזציה של שיטות תרבות לייצור אורגנוידים לשוניים מתאי גזע בוגרים תשפר את הרבייה ותקדם אורגנוידים לשוניים ככלי סינון תרופות רב עוצמה במאבק כדי לעזור לחולים חווים תפקוד לקוי של הטעם.
במכרסמים, בלוטות טעם לשוניות שוכנות בפפילות פטריות המופצות בחלק הקדמי, פפילאות עלווה דו-צדדיות אחוריות, כמו גם פפילה אחת (CVP) בקו האמצע posterodorsal של הלשון1. כל בלוטות טעם מורכבת מ-50-100 תאי קולטן טעם קצרי מועד המתחדשים במהירות (TRCs), הכוללים תאי תמיכה דמויי גליה מסוג I, תאי סוג II המזהים מתוקים, מרירים ואומאמי, ותאי סוג III המזהים חמוצים2,3,4. ב- CVP העכבר, LGR5+ תאי גזע לאורך הלמינה הבזלת מייצרים את כל סוגי ה- TRC, כמו גם תאים אפיתל שאינםטעם 5. בעת חידוש שושלת הטעם, תאי הבת של LGR5 מצוינים לראשונה כתאי מבשר טעם פוסט-מיוטי (תאי IV מסוג) המוזנים לבלוטות טעם ומסוגלים להבדיל לכל אחד משלושת סוגי TRC6. המחזור המהיר של TRCs הופך את מערכת הטעם רגישה לשיבושים על ידי טיפולים רפואיים, כולל קרינה וטיפולים תרופתיים מסוימים7,8,9,10,11,12,13. לכן, לימוד מערכת הטעם בהקשר של ויסות תאי גזע טעם ובידול TRC חיוני להבנת כיצד להקל או למנוע תפקוד לקוי של הטעם.
עכברים הם מודל מסורתי למחקרי in vivo במדעי הטעם שכן יש להם מערכת טעם מאורגנת בדומה לבני אדם14,15,16. עם זאת, עכברים אינם אידיאליים עבור מחקרים תפוקה גבוהה, כפי שהם יקרים לתחזוקה זמן רב לעבוד עם. כדי להתגבר על זה, שיטות תרבות האורגנויד במבחנה פותחו בשנים האחרונות. אורגנוידים טעם יכול להיווצר מרקמת CVP מקורית, תהליך שבו organoids ניצן מן האפיתל CVP עכבר מבודד תרבית ex vivo17. אורגנוידים אלה מציגים אפיתל רב שכבתי העולה בקנה אחד עם מערכת הטעם של in vivo. דרך יעילה יותר ליצור organoids שאינו דורש תרבות CVP ex vivo פותחה על ידי רן ואח‘בשנת 201418. התאמת שיטות ומדיה תרבית שפותחה לראשונה כדי לגדל organoids מעיים, הם בודדו Lgr5-GFP+ תאי אבות יחידים מ CVP העכבר וציפו אותם בג’ל מטריצה19. תאים בודדים אלה יצרו אורגנוידים לשוניים המתרבים במהלך 6 הימים הראשונים של התרבות, מתחילים להבדיל סביב יום 8, ועד סוף תקופת התרבות מכילים תאים אפיתל שאינם טעם וכל שלושת סוגי TRC18,20. עד כה פורסמו מחקרים רבים המשתמשים במערכת מודל האורגנויד הלינגואלי17,18,20,21,22; עם זאת, שיטות ותנאי תרבות המשמשים ליצירת organoids אלה משתנים בין פרסומים (טבלה משלימה 1). לכן, שיטות אלה הותאמו ומותאמו כאן כדי להציג פרוטוקול סטנדרטי מפורט לתרבות האורגנוידים הלשויים הנגזרים מ- LGR5+ אבות של CVP עכבר מבוגר.
אורגנוידים לשוניים מספקים מודל ייחודי לחקר התהליכים הביולוגיים של התא המניעים את התפתחות והתחדשות תאי הטעם. ככל שהיישומים של אורגנוידים לשוניים מתרחבים ומעבדות נוספות נעות לכיוון ניצול מודלים אורגנוידים במבחנה, חשוב שהתחום ישאף לפתח ולאמץ פרוטוקולים סטנדרטיים לשיפור יכולת הרבייה. הקמת organoids לשוני ככלי סטנדרטי במדעי הטעם תאפשר מחקרי תפוקה גבוהה להקניט לגזרים כיצד תאי גזע בודדים ליצור את התאים המובחנים של מערכת הטעם הבוגרת. בנוסף, אורגנוידים לשוניים יכולים להיות מועסקים כדי לסנן במהירות תרופות עבור השפעות פוטנציאליות על הומאוסטזיס טעם, אשר לאחר מכן ניתן לחקור ביסודיות רבה יותר במודלים בעלי חיים. גישה זו בסופו של דבר תגביר את המאמצים לתכנן טיפולים שישפרו את איכות החיים של מקבלי תרופות עתידיים.
דיווח כאן היא שיטה יעילה וניתן לחזור בקלות עבור culturing, תחזוקה, ועיבוד organoids לשוני נגזר מתאי גזע טעם עכבר למבוגרים. נמצא כי שימוש בשלושה CVPs מ Lgr5 בן 8 עד 20 שבועות–עכברי EGFP מספיק כדי להשיג ~ 10,000 GFP+ תאים לשימוש ניסיוני, וכתוצאה מכך 50 בארות מצופות בצפיפות של 200 תאים לבאר בלוחות 48-well. הסרת א?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לד”ר פיטר דמפסי ומוניקה בראון (אוניברסיטת קולורדו Anschutz קמפוס רפואי Organoid ורקמות מודל משאב משותף) על מתן מדיה מותנית WNR ודיונים יקרי ערך. אנו מודים גם לטכנולוגיות התאים של מרכז הסרטן של אוניברסיטת קולורדו ולמשאבים משותפים של Cytometry זרימה, במיוחד דמיטרי בטורין, על מומחיות במיון תאים. עבודה זו מומנה על-ידי: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, ו- NIH/NCI R21 CA236480 ל- LAB, ו- R21DC016131 ו- R21DC016131-02S1 ל- DG, ו- F32 DC015958 ל- EJG.
Antibodies | |||
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
Equipment | |||
2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
Water bath | Precision | 51220073 | |
Media | |||
A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Other | |||
1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
Needle | BD Syringe | 305106 | |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |