वयस्क माउस स्वाद स्टेम सेल से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी और संस्कृति
Summary
प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के पीछे के स्वाद पपीला से अलग स्वाद स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड को बनाने और प्रसंस्करण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
स्वाद की भावना जीभ पर स्वाद कलियों द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो तेजी से नवीनीकरण स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं (टीआरसी) से बना होते हैं। यह नित्य कारोबार स्थानीय जनक कोशिकाओं द्वारा संचालित होता है और चिकित्सा उपचारों की एक भीड़ द्वारा व्यवधान से ग्रस्त स्वाद कार्य प्रदान करता है, जो बदले में जीवन की गुणवत्ता को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। इस प्रकार, दवा उपचार के संदर्भ में इस प्रक्रिया का अध्ययन यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्वाद जनक समारोह और टीआरसी उत्पादन कैसे प्रभावित होते हैं। नैतिक चिंताओं और मानव स्वाद ऊतक की सीमित उपलब्धता को देखते हुए, माउस मॉडल, जो मनुष्यों के समान एक स्वाद प्रणाली है, आमतौर पर उपयोग किया जाता है । वीवो विधियों की तुलना में, जो समय लेने वाले, महंगे हैं, और उच्च थ्रूपुट अध्ययनों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं, मुरीन भाषाई ऑर्गेनॉइड कई प्रतिकृति और कम चूहों के साथ तेजी से चलाने के लिए प्रयोगों को सक्षम कर सकते हैं। यहां, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है और वयस्क चूहों के परिष्कार पैपिला (सीवीपी) से अलग स्वाद जनक कोशिकाओं से स्वाद ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक मानकीकृत विधि प्रस्तुत की गई है। सीवीपी एक्सप्रेस एलजीआर 5 में प्रोजेनिटर कोशिकाओं का स्वाद लें और एलजीआर 5ईजीएफपी-आईईईएस-क्रेर्ट2 एलील ले जाने वाले चूहों से ईजीएफपी फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) के माध्यम से अलग किया जा सकता है। सॉर्ट कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल-आधारित 3 डी संस्कृति प्रणाली पर चढ़ाया जाता है और 12 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। ऑर्गेनॉइड प्रसार के माध्यम से संस्कृति अवधि के पहले 6 दिनों के लिए विस्तार करते हैं और फिर एक भेदभाव चरण में प्रवेश करते हैं, जिसके दौरान वे गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ सभी तीन स्वाद सेल प्रकार उत्पन्न करते हैं। ऑर्गेनॉइड को आरएनए अभिव्यक्ति और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए विकास प्रक्रिया के दौरान 12 दिन या किसी भी समय परिपक्वता पर काटा जा सकता है। वयस्क स्टेम कोशिकाओं से भाषाई ऑर्गेनॉइड के उत्पादन के लिए संस्कृति विधियों का मानकीकरण प्रजनन क्षमता में सुधार करेगा और स्वाद की शिथिलता का सामना करने वाले रोगियों की मदद करने के लिए लड़ाई में एक शक्तिशाली दवा स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में भाषाई ऑर्गेनॉइड को आगे बढ़ाएगा।
Introduction
कृंतकों में, भाषाई स्वाद कलियों को फंगसफॉर्म पैपिली में रखा जाता है जो पूर्वकाल में वितरित होता है, द्विपक्षीय पत्ते papillae पीछे, साथ ही जीभ1के पोस्टरोडर्सल मिडलाइन पर एक एकल परिधीय पैपिला (सीवीपी) । प्रत्येक स्वाद कली 50-100 अल्पकालिक, तेजी से नवीनीकरण स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं (टीआरसी) से बना है, जिसमें टाइप आई ग्लियल जैसी समर्थन कोशिकाएं, प्रकार II कोशिकाएं शामिल हैं जो मीठे, कड़वे और उमामी का पता लगाती हैं, और टाइप III कोशिकाएं जो खट्टे2,3,4का पता लगाती हैं। माउस सीवीपी में, बेसल लैमिना के साथ एलजीआर 5+ स्टेम सेल सभी टीआरसी प्रकारों के साथ-साथ गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं5। स्वाद वंश का नवीनीकरण करते समय, एलजीआर 5 बेटी कोशिकाओं को पहले पोस्ट-मिटोटिक स्वाद अग्रदूत कोशिकाओं (टाइप IV कोशिकाओं) के रूप में निर्दिष्ट किया जाता है जो स्वाद की कली में प्रवेश करते हैं और तीन टीआरसी प्रकार6में से किसी में अंतर करने में सक्षम हैं। टीआरसी का तेजी से कारोबार चिकित्सा उपचारों द्वारा व्यवधान के लिए अतिसंवेदनशील स्वाद प्रणाली को प्रस्तुत करता है, जिसमें विकिरण और कुछदवा उपचार7,8,9,10, 11,12,13शामिल हैं। इस प्रकार, स्वाद स्टेम सेल विनियमन और टीआरसी भेदभाव के संदर्भ में स्वाद प्रणाली का अध्ययन यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्वाद की शिथिलता को कम या कैसे रोका जाए।
चूहे स्वाद विज्ञान में वीवो अध्ययन के लिए एक पारंपरिक मॉडल हैं क्योंकि उनके पास मनुष्यों के समान ही स्वाद प्रणाली है14,15,16. हालांकि, चूहों उच्च थ्रूपुट अध्ययनों के लिए आदर्श नहीं हैं, क्योंकि वे काम करने के लिए बनाए रखने और समय लेने वाले महंगे हैं। इसे दूर करने के लिए, हाल के वर्षों में इन विट्रो ऑर्गेनॉइड संस्कृति विधियों का विकास किया गया है। स्वाद ऑर्गेनॉइड देशी सीवीपी ऊतक से उत्पन्न किया जा सकता है, एक प्रक्रिया जिसमें ऑर्गेनॉइड अलग माउस सीवीपी एपिथेलियम सुसंस्कृत पूर्व वीवो17से बंद हो जाते हैं। ये ऑर्गेनॉइड वीवो स्वाद प्रणाली के अनुरूप एक बहुस्तरीय एपिथेलियम प्रदर्शित करते हैं। ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने का एक अधिक कुशल तरीका जिसे पूर्व वीवो सीवीपी संस्कृति की आवश्यकता नहीं होती है , रेन एटअल द्वारा 201418में विकसित किया गया था। अनुकूल तरीकों और संस्कृति मीडिया पहले आंतों के ऑर्गेनॉइड विकसित करने के लिए विकसित, वे माउस सीवीपी से एकल Lgr5-GFP+ जनक कोशिकाओं को अलग और उन्हें मैट्रिक्स जेल19में चढ़ाया । इन एकल कोशिकाओं ने भाषाई ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किए जो संस्कृति के पहले 6 दिनों के दौरान पैदा होते हैं, 8 दिन के आसपास अंतर करना शुरू कर देते हैं, और संस्कृति अवधि के अंत तक गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाएं और सभी तीन टीआरसी प्रकार18,20होते हैं। आज तक, भाषाई ऑर्गेनॉइड मॉडल प्रणाली का उपयोग करने वाले कई अध्ययन17,18,20,21, 22प्रकाशित किए गए हैं। हालांकि, इन ऑर्गेनॉइड को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाले तरीके और संस्कृति की स्थिति प्रकाशनों(अनुपूरक तालिका 1)में भिन्न होती है। इस प्रकार, इन तरीकों को वयस्क माउस सीवीपी के एलजीआर 5+ जनक से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड की संस्कृति के लिए एक विस्तृत मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए यहां समायोजित और अनुकूलित किया गया है।
भाषाई ऑर्गेनॉइड स्वाद सेल विकास और नवीकरण ड्राइविंग सेल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल प्रदान करते हैं। चूंकि भाषाई ऑर्गेनॉइड के अनुप्रयोगों का विस्तार होता है और अधिक प्रयोगशालाएं इन विट्रो ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग करने की ओर बढ़ती हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि क्षेत्र प्रजनन क्षमता में सुधार के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित करने और अपनाने का प्रयास करे। स्वाद विज्ञान के भीतर एक मानक उपकरण के रूप में भाषाई ऑर्गेनॉइड की स्थापना उच्च थ्रूपुट अध्ययनों को सक्षम करेगी जो अलग-अलग चिढ़ाती है कि एकल स्टेम कोशिकाएं वयस्क स्वाद प्रणाली की विभेदित कोशिकाओं को कैसे उत्पन्न करती हैं। इसके अतिरिक्त, भाषाई ऑर्गेनॉइड को स्वाद होमोस्टेसिस पर संभावित प्रभावों के लिए तेजी से स्क्रीन दवाओं के लिए नियोजित किया जा सकता है, जिसकी जांच पशु मॉडलों में अधिक अच्छी तरह से की जा सकती है। यह दृष्टिकोण अंततः उन उपचारों को ईजाद करने के प्रयासों में वृद्धि करेगा जो भविष्य के दवा प्राप्तकर्ताओं के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां रिपोर्ट वयस्क माउस स्वाद स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड को बनाने, बनाए रखने और प्रसंस्करण के लिए एक कुशल और आसानी से दोहराने योग्य विधि है। यह पाया गया कि 8 से 20 सप्ताह पुराने Lgr5-EGFP चूहों स…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक WNR वातानुकूलित मीडिया और मूल्यवान चर्चा प्रदान करने के लिए डॉ पीटर डेम्पसे और मोनिका ब्राउन (कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैंपस ऑर्गेनॉइड और ऊतक मॉडलिंग साझा संसाधन) के विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम सेल छंटाई विशेषज्ञता के लिए यूनिवर्सिटी ऑफ कोलोराडो कैंसर सेंटर सेल टेक्नोलॉजीज और फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधनों, विशेष रूप से दिमित्री बैटुरिन को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम के द्वारा वित्त पोषित किया गया था: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, और NIH/NCI R21 CA21 CA236480 लैब के लिए, और R21DC016131 और R21DC016131-02S1 डीजी के लिए, और F32 DC015958 EJG के लिए ।
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
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