Generering og kultur av lingual organoider avledet fra voksen mus smak stamceller
Summary
Protokollen presenterer en metode for dyrking og behandling av linguale organoider avledet fra smaksstammeceller isolert fra den bakre smaken papilla av voksne mus.
Abstract
Smakssansen formidles av smaksløker på tungen, som består av raskt fornyende smaksreseptorceller (TRCer). Denne kontinuerlige omsetningen drives av lokale stamceller og gjør smaksfunksjonen utsatt for forstyrrelser av en rekke medisinske behandlinger, noe som igjen påvirker livskvaliteten sterkt. Å studere denne prosessen i sammenheng med narkotikabehandling er derfor avgjørende for å forstå om og hvordan smaksforfedrederfunksjon og TRC-produksjon påvirkes. Gitt de etiske bekymringene og begrenset tilgjengelighet av menneskelig smaksvev, brukes musemodeller, som har et smakssystem som ligner på mennesker. Sammenlignet med in vivo-metoder, som er tidkrevende, dyre og ikke mottagelige for studier med høy gjennomstrømning, kan murine lingual organoider gjøre det mulig å kjøre eksperimenter raskt med mange replikeringer og færre mus. Her har tidligere publiserte protokoller blitt tilpasset og en standardisert metode for å generere smakorganoider fra smaksforfedrederceller isolert fra circumvallate papilla (CVP) av voksne mus presenteres. Smak forfedre celler i CVP uttrykke LGR5 og kan isoleres via EGFP fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) fra mus som bærer en Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 allele. Sorterte celler er belagt på et matrisegelbasert 3D-kultursystem og dyrket i 12 dager. Organoider utvides de første 6 dagene av kulturperioden via spredning og går deretter inn i en differensieringsfase, hvor de genererer alle tre smakscelletypene sammen med ikke-smak epitelceller. Organoider kan høstes ved modning på dag 12 eller når som helst under vekstprosessen for RNA-uttrykk og immunhiistokjemisk analyse. Standardisering av kulturmetoder for produksjon av linguale organoider fra voksne stamceller vil forbedre reproduserbarheten og fremme språklige organoider som et kraftig verktøy for legemiddelscreening i kampen for å hjelpe pasienter som opplever smaksdysfunksjon.
Introduction
Hos gnagere er lingual smaksløker plassert i soppform papiller fordelt fremre, bilateral foliat papillisk bakre, samt en enkelt circumvallate papilla (CVP) ved den bakre midtlinjen av tungen1. Hver smaksløk består av 50-100 kortvarige, raskt fornyende smaksreseptorceller (TRCer), som inkluderer type I glial-lignende støtteceller, type II-celler som oppdager søte, bitre og umami, og type III-celler som oppdager sure2,3,4. I musen CVP produserer LGR5+ stamceller langs basal lamina alle TRC-typer samt ikke-smak epitelceller5. Når du fornyer smakslinjen, blir LGR5-datterceller først spesifisert som post-mitotic smak forløperceller (type IV-celler) som skriver inn en smaksløk og er i stand til å differensiere i noen av de tre TRC-typene6. Den raske omsetningen av TRCer gjør smakssystemet utsatt for forstyrrelser ved medisinske behandlinger, inkludert stråling og visse legemiddelbehandlinger7,8,9,10,11,12,13. Dermed er det viktig å studere smakssystemet i sammenheng med smaksstammecelleregulering og TRC-differensiering for å forstå hvordan du kan redusere eller forhindre smaksdysfunksjon.
Mus er en tradisjonell modell for in vivo-studier i smaksvitenskap siden de har et smakssystem organisert på samme måte som mennesker14,15,16. Mus er imidlertid ikke ideelle for studier med høy gjennomstrømning, da de er dyre å vedlikeholde og tidkrevende å jobbe med. For å overvinne dette har in vitro organoide kulturmetoder blitt utviklet de siste årene. Smak organoider kan genereres fra innfødt CVP vev, en prosess der organoider knopper av fra isolert mus CVP epitel dyrket ex vivo17. Disse organoidene viser et flerlags epitel i samsvar med in vivo smakssystemet. En mer effektiv måte å generere organoider som ikke krever ex vivo CVP kultur ble utviklet av Ren et al. i 201418. Tilpasningsmetoder og kulturmedier utviklet seg først for å vokse tarmorganoider, de isolerte enkle Lgr5-GFP+ stamceller fra mus CVP og belagt dem i matrisegel19. Disse enkeltcellene genererte linguale organoider som sprer seg i løpet av de første 6 dagene av kulturen, begynner å skille seg rundt dag 8, og ved slutten av kulturperioden inneholder ikke-smak epitelceller og alle tre TRC-typer18,20. Til dags dato har flere studier som bruker det linguale organoidmodellsystemet blitt publisert17,18,20,21,22; Metoder og kulturforhold som brukes til å generere disse organoidene varierer imidlertid på tvers av publikasjoner (Supplerende tabell 1). Dermed har disse metodene blitt justert og optimalisert her for å presentere en detaljert standardisert protokoll for kulturen av lingual organoider avledet fra LGR5+ forfedre av voksen mus CVP.
Lingual organoider gir en unik modell for å studere cellebiologiske prosesser som driver smakscelleutvikling og fornyelse. Etter hvert som anvendelsene av linguale organoider utvides og flere laboratorier beveger seg mot å bruke in vitro organoid-modeller, er det viktig at feltet streber etter å utvikle og vedta standardiserte protokoller for å forbedre reproduserbarheten. Etablering av linguale organoider som et standardverktøy innen smaksvitenskap ville muliggjøre studier med høy gjennomstrømning som erter fra hverandre hvordan enkeltstammeceller genererer de differensierte cellene i det voksne smakssystemet. I tillegg kan linguale organoider brukes til raskt å screene legemidler for potensielle påvirkninger på smak homeostase, som deretter kan undersøkes grundigere i dyremodeller. Denne tilnærmingen vil til slutt styrke innsatsen for å utarbeide terapier som forbedrer livskvaliteten for fremtidige narkotikamottakere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rapportert her er en effektiv og lett repeterbar metode for dyrking, vedlikehold og behandling av språklige organoider avledet fra voksne musesmak stamceller. Det ble funnet at bruk av tre CVPer fra 8 til 20 uker gamle Lgr5–EGFP-mus er tilstrekkelig til å oppnå ~ 10.000 GFP+ celler for eksperimentell bruk, noe som resulterer i 50 brønner belagt med en tetthet på 200 celler per brønn i 48-brønnsplater. Fjerning av CVP grøft epithelia er optimalisert ved å injisere lingual epitel med nylaget Di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Dr. Peter Dempsey og Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) for å gi WNR betingede medier og verdifulle diskusjoner. Vi takker også University of Colorado Cancer Center Cell Technologies og Flow Cytometry Shared Resources, spesielt Dmitry Baturin, for cellesorteringsekspertise. Dette arbeidet ble finansiert av: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 og NIH/NCI R21 CA236480 til LAB, og R21DC016131 og R21DC016131-02S1 til DG, og F32 DC015958 til EJG.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. . The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients’ food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. . Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v., Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
