Generation och kultur av linguala organoider som härrör från vuxna mussmak stamceller
Summary
Protokollet presenterar en metod för odling och bearbetning av linguala organoider som härrör från smakstamceller isolerade från den bakre smakpapilla av vuxna möss.
Abstract
Smaksinnet förmedlas av smaklökar på tungan, som består av snabbt förnyande smakreceptorceller (TRCs). Denna kontinuerliga omsättning drivs av lokala stamceller och gör smakfunktionen benägen för störningar genom en mängd medicinska behandlingar, vilket i sin tur allvarligt påverkar livskvaliteten. Att studera denna process i samband med läkemedelsbehandling är därför avgörande för att förstå om och hur smak avkomma funktion och TRC produktion påverkas. Med tanke på de etiska problemen och den begränsade tillgången på mänsklig smakvävnad används musmodeller, som har ett smaksystem som liknar människor, ofta. Jämfört med in vivo-metoder, som är tidskrävande, dyra och inte mottagliga för studier med hög genomströmning, kan murinspråkiga organoider göra det möjligt att köra experiment snabbt med många replikat och färre möss. Här har tidigare publicerade protokoll anpassats och en standardiserad metod för att generera smakorganoider från smakprogenitorceller isolerade från omkretspaljilla (CVP) hos vuxna möss presenteras. Smaka av stamceller i CVP express LGR5 och kan isoleras via EGFP fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) från möss som bär en Lgr5EGFP-IRES-CreERT2-allel. Sorterade celler pläteras på ett matrisgelbaserat 3D-odlingssystem och odlas i 12 dagar. Organoider expanderar under de första 6 dagarna av kulturperioden via spridning och går sedan in i en differentieringsfas, under vilken de genererar alla tre smakcelltyperna tillsammans med icke-smakepitela celler. Organoider kan skördas vid mognad vid dag 12 eller när som helst under tillväxtprocessen för RNA-uttryck och immunohistokemisk analys. Standardisering av odlingsmetoder för produktion av linguala organoider från vuxna stamceller kommer att förbättra reproducerbarheten och främja linguala organoider som ett kraftfullt läkemedel screening verktyg i kampen för att hjälpa patienter som upplever smak dysfunktion.
Introduction
Hos gnagare är linguala smaklökar inrymda i svampform papillae fördelad främre, bilaterala bladpafeillaer baktill, liksom en enda cirkumvallate papilla (CVP) vid den bakre midlinen på tungan1. Varje smakknopp består av 50-100 kortlivade, snabbt förnyande smakreceptorceller (TRCs), som inkluderar typ I-glialiknande stödceller, typ II-celler som upptäcker söta, bittra och umami och typ III-celler som detekterarsura 2,3,4. I musen CVP producerar LGR5+ stamceller längs basal lamina alla TRC-typer samt icke-smak epitelceller5. Vid förnyelse av smak härstamningen anges LGR5 dotterceller först som post-mitotic smakprekursorceller (typ IV celler) som går in i en smaklök och kan differentiera till någon av de tre TRCtyperna 6. Den snabba omsättningen av TRCs gör smaksystemet mottagligt för störningar genom medicinska behandlingar, inklusive strålning och vissa läkemedelsbehandlingar7,8,9,10,11,12,13. Att studera smaksystemet i samband med smakstamcellsreglering och TRC-differentiering är därför avgörande för att förstå hur man mildrar eller förhindrar smakdysfunktion.
Möss är en traditionell modell för in vivo-studier i smakvetenskap eftersom de har ett smaksystem organiserat på samma sätt som människor14,15,16. Möss är dock inte idealiska för studier med hög genomströmning, eftersom de är dyra att underhålla och tidskrävande att arbeta med. För att övervinna detta har in vitro organoidkulturmetoder utvecklats under de senaste åren. Smakorganoider kan genereras från inhemsk CVP-vävnad, en process där organoider knoppar av från isolerade mus CVP epitel odlas ex vivo17. Dessa organoider visar ett flerskiktat epitel som överensstämmer med in vivo-smaksystemet. Ett effektivare sätt att generera organoider som inte kräver ex vivo CVP-kultur utvecklades av Ren et al. 201418. Anpassa metoder och kultur medier först utvecklats för att växa intestinala organoider, isolerade de singel Lgr5-GFP+ stamceller från mus CVP och pläterade dem i matrisgel19. Dessa enstaka celler genererade linguala organoider som förökar sig under de första 6 dagarna av kulturen, börjar skilja runt dag 8, och i slutet av kulturperioden innehåller icke-smak epitelceller och alla tre TRC typer18,20. Hittills har flera studier som använder det språkliga organoidmodellsystemet publicerats17,18,20,21,22; Metoder och odlingsförhållanden som används för att generera dessa organoider varierar dock mellan publikationerna(tilläggstabell 1). Således har dessa metoder justerats och optimerats här för att presentera ett detaljerat standardiserat protokoll för kulturen av linguala organoider som härrör från LGR5+ föregångare till vuxna mus CVP.
Linguala organoider ger en unik modell för att studera cellbiologiska processer som driver smakcellsutveckling och förnyelse. I och med att tillämpningarna av linguala organoider expanderar och fler laboratorier rör sig mot att använda in vitro-organoidmodeller är det viktigt att fältet strävar efter att utveckla och anta standardiserade protokoll för att förbättra reproducerbarheten. Att etablera linguala organoider som ett standardverktyg inom smakvetenskap skulle möjliggöra studier med hög genomströmning som retar isär hur enstaka stamceller genererar de differentierade cellerna i vuxensmakssystemet. Dessutom kan linguala organoider användas för att snabbt screena läkemedel för potentiella effekter på smakhomeostas, som sedan skulle kunna undersökas mer noggrant i djurmodeller. Detta tillvägagångssätt kommer i slutändan att öka ansträngningarna för att utforma terapier som förbättrar livskvaliteten för framtida läkemedelsmottagare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rapporteras här är en effektiv och lätt repeterbar metod för odling, underhåll och bearbetning av linguala organoider som härrör från vuxna mussmak stamceller. Det konstaterades att använda tre CVPs från 8 till 20 veckor gamla Lgr5–EGFP möss är tillräckligt för att få ~ 10,000 GFP+ celler för experimentell användning, vilket resulterar i 50 brunnar pläterade med en densitet av 200 celler per brunn i 48-brunnsplattor. Avlägsnande av CVP dike epithelia optimeras genom att injicera lin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr. Peter Dempsey och Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) för att ge WNR betingade medier och värdefulla diskussioner. Vi tackar också University of Colorado Cancer Center Cell Technologies och Flow Cytometry Shared Resources, särskilt Dmitry Baturin, för cellsorteringsexpertis. Detta arbete finansierades av: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 och NIH/NCI R21 CA236480 till LAB och R21DC016131 och R21DC016131-02S1 till GD och F32 DC015958 till EJG.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. . The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients’ food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. . Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v., Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
