Bestimmung von Gesamtlipid und Lipidklassen in marinen Proben
Summary
Dieses Protokoll dient zur Bestimmung von Lipiden in Meerwasser und biologischen Proben. Lipide in Filtraten werden mit Chloroform oder Mischungen von Chloroform und Methanol im Falle von Feststoffen extrahiert. Lipidklassen werden durch Stäbchendünnschichtchromatographie mit Flammenionisationsdetektion gemessen und ihre Summe ergibt den Gesamtlipidgehalt.
Abstract
Lipide bestehen größtenteils aus Kohlenstoff und Wasserstoff und liefern daher eine größere spezifische Energie als andere organische Makromoleküle im Meer. Da sie kohlenstoff- und wasserstoffreich sind, sind sie auch hydrophob und können als Lösungsmittel und Absorptionsträger für organische Schadstoffe fungieren und somit Treiber der Schadstoffbioakkumulation in marinen Ökosystemen sein. Ihre hydrophobe Natur erleichtert ihre Isolierung von Meerwasser oder biologischen Proben: Die marine Lipidanalyse beginnt mit der Probenahme und dann der Extraktion in unpolaren organischen Lösungsmitteln und bietet eine bequeme Methode für ihre Trennung von anderen Substanzen in einer aquatischen Matrix.
Wenn Meerwasser beprobt wurde, besteht der erste Schritt in der Regel darin, durch Filtration in operativ definierte “gelöste” und “partikuläre” Fraktionen zu trennen. Proben werden entnommen und Lipide aus der Probenmatrix isoliert, typischerweise mit Chloroform für wirklich gelöste Stoffe und Kolloide und mit Mischungen aus Chloroform und Methanol für Feststoffe und biologische Proben. Solche Extrakte können mehrere Klassen aus biogenen und anthropogenen Quellen enthalten. Zu diesem Zeitpunkt können Gesamtlipide und Lipidklassen bestimmt werden. Das Gesamtlipid kann gemessen werden, indem individuell bestimmte Lipidklassen summiert werden, die üblicherweise chromatographisch getrennt wurden. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Flammenionisationsdetektion (FID) wird regelmäßig zur quantitativen Analyse von Lipiden aus marinen Proben eingesetzt. TLC-FID liefert synoptische Lipidklasseninformationen und durch Summieren von Klassen eine Gesamtlipidmessung.
Informationen zur Lipidklasse sind besonders nützlich, wenn sie mit Messungen einzelner Komponenten, z. B. Fettsäuren und/oder Sterole, nach ihrer Freisetzung aus Lipidextrakten kombiniert werden. Die große Vielfalt an Lipidstrukturen und -funktionen bedeutet, dass sie in der ökologischen und biogeochemischen Forschung umfassend eingesetzt werden, um die Gesundheit des Ökosystems und den Grad des Einflusses durch anthropogene Auswirkungen zu bewerten. Sie wurden verwendet, um Substanzen von diätetischem Wert für die Meeresfauna (z. B. Aquafeeds und / oder Beute) und als Indikator für die Wasserqualität (z. B. Kohlenwasserstoffe) zu messen.
Introduction
Die hier beschriebenen Methoden betreffen Stoffe, die operativ als marine Lipide definiert sind. Diese Definition basiert auf ihrer Zugänglichkeit zur Flüssig-Flüssig-Extraktion in unpolaren organischen Lösungsmitteln und bietet eine bequeme Methode für ihre Trennung von anderen Substanzen in einer aquatischen Matrix. Ihre hydrophobe Natur erleichtert ihre Isolierung von Meerwasser oder biologischen Proben sowie deren Anreicherung und die Entfernung von Salzen und Proteinen.
Die Messung des Lipidgehalts und seiner Zusammensetzung in Meeresorganismen ist seit Jahrzehnten in der Nahrungsnetzökologie, der Aquakulturernährung und der Lebensmittelwissenschaft von großem Interesse. Lipide sind universelle Komponenten in lebenden Organismen, die als essentielle Moleküle in Zellmembranen fungieren, als Hauptquellen bioverfügbarer Energie, für Wärmeisolierung und Auftrieb sorgen und als Signalmoleküle dienen. Obwohl Verfahren zur Lipidbestimmung in anderen Bereichen gut beschrieben wurden, erfordert ihre Verwendung mit marinen Proben häufig Modifikationen, um sich an die Feldbedingungen sowie an den Probentyp1anzupassen.
Bei Meerwasserproben erfordert der erste Schritt in der Regel eine Trennung in die operativ definierten “gelösten” und “partikulären” Fraktionen, normalerweise durch Filtration (Protokoll schritt 1). Die Partikelfraktion ist das, was vom Filter zurückgehalten wird, und die Größe der Poren ist wichtig für die Definition des Cut-offs2. Wenn wir Feinstaubproben nehmen, möchten wir häufig die Lipidkonzentrationen mit den Gesamtmassenkonzentrationen in Beziehung setzen, in diesem Fall muss zu diesem Zweck eine separate, kleinere Probe (z. B. 10 ml) entnommen werden (Protokoll Schritt 1, Anmerkung). Um eine genaue Massenbestimmung zu erhalten, ist es wichtig, am Ende der Filtration Ammoniumformiat (35 g/L) hinzuzufügen.
Das Meerwasserfiltrat aus der größeren Probe sollte je nach Probentyp zwischen 250 mL und 1 L betragen und wird in einem Scheidetrichter einer Flüssig-Flüssig-Extraktion unterzogen (Protokollschritt 2). Die hydrophobe Natur von Lipiden bedeutet, dass sie durch Extraktion in einem unpolaren Lösungsmittel wie Chloroform von anderen Verbindungen getrennt werden können. Es entsteht ein zweischichtiges System, bei dem sich Lipide in die organische Schicht aufteilen, während wasserlösliche Komponenten in der wässrigen Schicht verbleiben.
Partikuläre Proben auf einem Filter oder biologische Proben werden mit einer modifizierten Folch et al. Extraktion3, ebenfalls unter Einbeziehung von Chloroform , extrahiert (Protokoll schritt 3). Auch hier entsteht ein organisch-wässriges System, in dem sich Lipide in die organische Phase aufteilen, während wasserlösliche Moleküle in der wässrigen Phase verbleiben und Proteine ausgefällt werden. Tatsächlich verwenden die meisten Laboratorien für Feststoffe eine Variation des Extraktionsverfahrens von Folch et al.mit Chloroform und Methanol. Für Filter besteht der erste Schritt darin, in 2 ml Chloroform und 1 ml Methanol zu homogenisieren.
Während der Extraktion sollte darauf geachtet werden, Lipide vor chemischer oder enzymatischer Veränderung zu schützen, indem Proben und Lösungsmittel auf Eis aufbewahrt werden, um die Esterbindungshydrolyse oder die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungsoxidation zu reduzieren. Gewebe und Zelllipide sind durch natürliche Antioxidantien und durch Kompartimentierung recht gut geschützt4; Nach der Homogenisierung der Proben werden jedoch Zellinhalte kombiniert, wodurch Lipide chemisch oder enzymatisch stärker zur Veränderung neigen. Einige Lipide, wie die meisten Sterole, sind sehr stabil, während andere, wie solche, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthalten, anfälliger für chemische Oxidation sind. Andere, wie Sterole mit konjugierten Doppelbindungen, sind anfällig für Oxidation, die durch Licht katalysiert wird5. Nach Extraktionen sind Lipide viel anfälliger für chemische Oxidation, und Proben sollten unter einem Inertgas wie Stickstoff gelagert werden. Ein sanfter Stickstoffstrom würde auch verwendet, um Extrakte zu konzentrieren.
Nach der Konzentration würden Lipide dann normalerweise in großen Mengen quantifiziert, da sie ein wichtiger Bestandteil mariner Ökosysteme sind und eine hohe Energiekonzentration liefern, mehr als das Doppelte des kJ / g von Kohlenhydraten und Proteinen. Ausnahmslos würden sie als nächstes als einzelne Komponenten quantifiziert werden: Die umfassende Analyse von Lipiden beinhaltet in der Regel eine Trennung in einfachere Kategorien, je nach ihrer chemischen Natur. Eine vollständige Analyse beinhaltet also die Messung von Gesamtlipiden, Lipidklassen und einzelnen Verbindungen.
Das Gesamtlipid kann bestimmt werden, indem man die Summe der einzeln gemessenen Lipidklassen nimmt, die durch Chromatographie getrennt werden6. Ein mariner Lipidextrakt kann mehr als ein Dutzend Klassen aus biogenen und anthropogenen Quellen enthalten. Die große Vielfalt der Lipidstrukturen bedeutet, dass viele Informationen durch die Bestimmung einzelner Gruppierungen von Strukturen gewonnen werden können. Lipidklassen einzeln oder in bestimmten Gruppen wurden verwendet, um das Vorhandensein bestimmter Arten von Organismen sowie deren physiologischen Status und Aktivitätzu signalisieren 2. Sie wurden auch als Indikator für die Herkunft von organischem Material verwendet, einschließlich gelöster organischer Substanz (DOM) sowie hydrophober Verunreinigungen.
Triacylglycerole, Phospholipide und Sterole gehören zu den wichtigeren biogenen Lipidklassen. Die ersten beiden sind biochemisch verwandt, da sie ein Glycerin-Rückgrat besitzen, an dem zwei oder drei Fettsäuren verestert sind (Abbildung 1). Triacylglycerole sind zusammen mit Wachsestern sehr wichtige Speicherstoffe, während andere fettsäurehaltige Lipidklassen wie Diacylglycerole, freie Fettsäuren und Monoacylglycerole im Allgemeinen nebensächliche Bestandteile sind. Freie Fettsäuren sind in geringeren Konzentrationen in lebenden Organismen vorhanden, da die ungesättigten giftig sein können7. Sterole (sowohl in ihrer freien als auch in ihrer veresterten Form) und Fettalkohole gehören ebenfalls zu den weniger polaren Lipiden, während Glykolipide und Phospholipide polare Lipide sind. Polare Lipide haben eine hydrophile Gruppe, die die Bildung von Lipiddoppelschichten in Zellmembranen ermöglicht. Freie Sterole sind auch Membranstrukturkomponenten, und wenn sie im Verhältnis zu Triacylglycerinen eingenommen werden, liefern sie einen Zustand oder Nährwertindex (TAG: ST), der weit verbreitet ist8. Wenn sie im Verhältnis zu Phospholipiden (ST : PL) eingenommen werden, können sie verwendet werden, um die Empfindlichkeit der Pflanze gegenüber Salz anzuzeigen: Höhere Werte erhalten die strukturelle Integrität und verringern die Membranpermeabilität9. Die Umkehrung dieses Verhältnisses (PL : ST) wurde in Muschelgewebe während der Temperaturanpassunguntersucht 10.
Marine Lipidklassen können durch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgel-beschichteten Stäbchen getrennt werden (Protokollschritt 4) und dann durch Flammenionisationsdetektion (FID) in einem automatischen FID-Scanner detektiert und quantifiziert werden. TLC/FID wird routinemäßig für marine Proben verwendet, da es schnell synoptische Lipidklassendaten aus kleinen Proben liefert und durch die Summe aller Klassen einen Wert für die Gesamtlipide nimmt. TLC/FID wurde einer Qualitätssicherungsbewertung (QS) unterzogen und es wurde festgestellt, dass sie die Standards erfüllt, die für eine konsistente externe Kalibrierung, niedrige Leerwerte und eine präzise Replikatanalyse erforderlich sind11. Variationskoeffizienten (CV) oder relative Standardabweichungen liegen bei etwa 10%, und die Gesamtlipiddaten des FID-Scanners betragen normalerweise etwa 90% derjenigen, die mit gravimetrischen und anderen Methoden erhalten werden2. Die Gravimetrie ergibt wahrscheinlich höhere Gesamtlipide, da der FID-Scanner nur nichtflüchtige Verbindungen misst und auch aufgrund einer möglichen Einbeziehung von nicht-lipidischem Material in gravimetrische Messungen.
Die Informationen, die durch die Lipidklassenanalyse geliefert werden, sind besonders nützlich, wenn sie mit Bestimmungen von Fettsäuren als Individuen oder Sterole oder den beiden in Kombination kombiniert werden. Der erste Schritt zu diesen Analysen beinhaltet die Freisetzung aller Komponentenfettsäuren zusammen mit Sterolen in den Lipidextrakten (Protokollschritt 5). Die große Vielfalt an Lipidstrukturen und -funktionen bedeutet, dass sie in ökologischen und biogeochemischen Studien zur Bewertung der Ökosystemgesundheit und des Ausmaßes, in dem sie durch anthropogene und terrestrische Inputs beeinflusst wurden, breite Anwendung gefunden haben. Sie wurden verwendet, um die Biosynthese von Substanzen zu messen, die für die Meeresfauna von diätetischem Wert sind, sowie um die Qualität von Wasserproben anzuzeigen. Die Messung von Lipiden in Sedimentkernproben hilft, die Empfindlichkeit von Sedimenten gegenüber Veränderungen der menschlichen Landnutzung in der Nähe des Land-Meer-Randes zu zeigen.
Das primäre Werkzeug zur Identifizierung und Quantifizierung einzelner Lipidverbindungen war traditionell die Gaschromatographie (GC) mit FID. Vor der Analyse werden diese Verbindungen jedoch durch Derivatisierung flüchtiger gemacht. Fettsäuren werden in Gegenwart eines sauren Katalysators(H2SO4)aus Acyllipidklassen freigesetzt (Abbildung 1). In der organischen Chemie leitet sich die Acylgruppe (R-C=O) üblicherweise von einer Carbonsäure (R-COOH) ab. Sie werden dann zu Fettsäuremethylestern (FAME) verestert, was zu besseren Trennungen auf GC-Säulen führt (Protokollschritt 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Geschwindigkeit, mit der das TLC-FID-System synoptische Lipidklasseninformationen aus kleinen Proben liefert, macht TLC-FID zu einem fähigen Werkzeug für das Screening von Meeresproben, bevor komplexere Analyseverfahren durchgeführt werden. Solche Analysen erfordern in der Regel die Freisetzung von Komponentenverbindungen aus Lipidextrakten und die Derivatisierung, um die Flüchtigkeit im Falle der Gaschromatographie zu erhöhen. TLC-FID in Kombination mit GC-FID hat sich als leistungsstarke Kombination für Extra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Fördernummer des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) 105379 an C.C. Parrish finanziert. Das Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) Network der Memorial University half bei der Finanzierung dieser Publikation.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
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