Determinación de clases totales de lípidos y lípidos en muestras marinas
Summary
Este protocolo es para la determinación de lípidos en agua de mar y especímenes biológicos. Los lípidos en los filtrados se extraen con cloroformo o mezclas de cloroformo y metanol en el caso de los sólidos. Las clases de lípidos se miden mediante cromatografía de capa delgada de varilla con detección de ionización de llama y su suma da el contenido total de lípidos.
Abstract
Los lípidos están compuestos en gran parte de carbono e hidrógeno y, por lo tanto, proporcionan una mayor energía específica que otras macromoléculas orgánicas en el mar. Al ser ricos en carbono e hidrógeno, también son hidrófobos y pueden actuar como disolventes y portadores de absorción de contaminantes orgánicos y, por lo tanto, pueden ser impulsores de la bioacumulación de contaminantes en los ecosistemas marinos. Su naturaleza hidrofóbica facilita su aislamiento del agua de mar o de especímenes biológicos: el análisis de lípidos marinos comienza con el muestreo y luego la extracción en disolventes orgánicos no polares, proporcionando un método conveniente para su separación de otras sustancias en una matriz acuática.
Si se ha muestreado agua de mar, el primer paso generalmente implica la separación en facciones “disueltas” y “partículas” definidas operativamente por filtración. Se recogen muestras y se aíslan lípidos de la matriz muestral típicamente con cloroformo para materia verdaderamente disuelta y coloides, y con mezclas de cloroformo y metanol para sólidos y especímenes biológicos. Dichos extractos pueden contener varias clases de fuentes biogénicas y antropogénicas. En este momento, se pueden determinar los lípidos totales y las clases de lípidos. El lípido total se puede medir sumando clases de lípidos determinadas individualmente que habitualmente se han separado cromatográficamente. La cromatografía de capa delgada (TLC) con detección de ionización de llama (FID) se utiliza regularmente para el análisis cuantitativo de lípidos de muestras marinas. TLC-FID proporciona información de clase de lípidos sinópticos y, sumando clases, una medición total de lípidos.
La información sobre la clase de lípidos es especialmente útil cuando se combina con mediciones de componentes individuales, por ejemplo, ácidos grasos y / o esteroles, después de su liberación de extractos de lípidos. La amplia variedad de estructuras y funciones lipídicas significa que se utilizan ampliamente en la investigación ecológica y biogeoquímica que evalúa la salud de los ecosistemas y el grado de influencia de los impactos antropogénicos. Se han empleado para medir sustancias de valor dietético para la fauna marina (por ejemplo, alimentos acuícolas y / o presas), y como un indicador de la calidad del agua (por ejemplo, hidrocarburos).
Introduction
Los métodos descritos aquí se refieren a sustancias que se definen operativamente como lípidos marinos. Esta definición se basa en su capacidad para la extracción líquido-líquido en disolventes orgánicos no polares, y proporciona un método conveniente para su separación de otras sustancias en una matriz acuática. Su carácter hidrófobo facilita su aislamiento del agua de mar o de ejemplares biológicos, así como su enriquecimiento, y la eliminación de sales y proteínas.
La medición del contenido de lípidos y su composición en organismos marinos ha sido de gran interés en la ecología de la red alimentaria, la nutrición acuícola y la ciencia de los alimentos durante décadas. Los lípidos son componentes universales en los organismos vivos, que actúan como moléculas esenciales en las membranas celulares, como fuentes principales de energía biodisponible, proporcionando aislamiento térmico y flotabilidad, y sirviendo como moléculas de señalización. Aunque los procedimientos para la determinación de lípidos en otros campos se han descrito bien, su uso con muestras marinas comúnmente requiere modificaciones para adaptarse a las condiciones del campo, así como a la muestra tipo1.
Para las muestras de agua de mar, el primer paso generalmente requiere la separación en las fracciones “disueltas” y “partículas” definidas operativamente, normalmente por filtración (paso 1 del Protocolo). La fracción de partículas es lo que retiene el filtro, y el tamaño de los poros es importante para definir el corte2. A menudo, cuando estamos muestreando material particulado, nos gustaría relacionar las concentraciones de lípidos con las concentraciones de masa total, en cuyo caso se debe tomar una muestra separada y más pequeña (por ejemplo, 10 ml) para este propósito (paso 1 del Protocolo, nota). Para obtener una determinación precisa de la masa, es importante agregar formiato de amonio (35 g / L) al final de la filtración.
El filtrado de agua de mar de la muestra más grande debe ascender a entre 250 ml y 1 L dependiendo del tipo de muestra y se somete a extracción líquido-líquido en un embudo separador (paso 2 del protocolo). La naturaleza hidrofóbica de los lípidos significa que pueden separarse de otros compuestos mediante la extracción en un disolvente no polar como el cloroformo. Se crea un sistema de dos capas donde los lípidos se dividen en la capa orgánica mientras que los componentes solubles en agua permanecen en la capa acuosa.
Las muestras de partículas en un filtro, o muestras biológicas se extraen con una extracción modificada de Folch et al.3, que también involucra cloroformo (Protocolo paso 3). Una vez más, se crea un sistema orgánico / acuoso en el que los lípidos se dividen en la fase orgánica, mientras que las moléculas solubles en agua permanecen en la fase acuosa y las proteínas se precipitan. De hecho, para los sólidos, la mayoría de los laboratorios utilizan alguna variación del procedimiento de extracción de Folch et al.3 que involucra cloroformo y metanol. Para los filtros, el primer paso es homogeneizar en 2 mL de cloroformo y 1 mL de metanol.
Durante la extracción, se debe tener cuidado de proteger los lípidos de la modificación química o enzimática, manteniendo muestras y disolventes en hielo para reducir la hidrólisis del enlace éster o la oxidación de doble enlace carbono-carbono. Los tejidos y los lípidos celulares están bastante bien protegidos por antioxidantes naturales y por compartimentación4; sin embargo, después de la homogeneización de las muestras, los contenidos celulares se combinan haciendo que los lípidos estén más dispuestos a la alteración, química o enzimáticamente. Algunos lípidos, como la mayoría de los esteroles, son muy estables, mientras que otros, como los que contienen ácidos grasos poliinsaturados, son más susceptibles a la oxidación química. Otros, como los esteroles con dobles enlaces conjugados, son propensos a la oxidación catalizada por la luz5. Después de las extracciones, los lípidos son mucho más susceptibles a la oxidación química, y las muestras deben almacenarse bajo un gas inerte como el nitrógeno. También se utilizaría una corriente suave de nitrógeno para concentrar los extractos.
Después de la concentración, los lípidos normalmente se cuantificarían a granel, ya que son un componente importante de los ecosistemas marinos que proporcionan una alta concentración de energía, más del doble de kJ / g de carbohidratos y proteínas. Invariablemente se cuantificarían a continuación como componentes individuales: el análisis exhaustivo de los lípidos generalmente implica la separación en categorías más simples, de acuerdo con su naturaleza química. Por lo tanto, un análisis completo implica medir lípidos totales, clases de lípidos y compuestos individuales.
El lípido total se puede determinar tomando la suma de clases de lípidos medidas individualmente separadas por cromatografía6. Un extracto de lípidos marinos puede contener más de una docena de clases de fuentes biogénicas y antropogénicas. La amplia variedad de estructuras lipídicas significa que se puede obtener mucha información al determinar agrupaciones individuales de estructuras. Las clases de lípidos individualmente, o en ciertos grupos, se han utilizado para señalar la presencia de ciertos tipos de organismos, así como su estado fisiológico y actividad2. También se han utilizado como un indicador de los orígenes de la materia orgánica, incluida la materia orgánica disuelta (DOM), así como los contaminantes hidrofóbicos.
Los triacilgliceroles, fosfolípidos y esteroles se encuentran entre las clases de lípidos biogénicos más importantes. Los dos primeros están relacionados bioquímicamente ya que poseen una columna vertebral de glicerol a la que se esterifican dos o tres ácidos grasos(Figura 1). Los triacilgliceroles, junto con los ésteres de cera son sustancias de almacenamiento muy importantes, mientras que otras clases de lípidos que contienen ácidos grasos, como los diacilgliceroles, los ácidos grasos libres y los monoacilgliceroles son generalmente constituyentes menores. Los ácidos grasos libres están presentes en concentraciones más bajas en los organismos vivos, ya que los insaturados pueden ser tóxicos7. Los esteroles (tanto en sus formas libres como esterificadas) y los alcoholes grasos también se incluyen entre los lípidos menos polares, mientras que los glicolípidos y fosfolípidos son lípidos polares. Los lípidos polares tienen un grupo hidrófilo, que permite la formación de bicapas lipídicas que se encuentran en las membranas celulares. Los esteroles libres también son componentes estructurales de la membrana, y cuando se toman en proporción a los triacilgliceroles proporcionan una condición o índice nutricional (TAG: ST) que ha sido ampliamente utilizado8. Cuando se toman en proporción a los fosfolípidos (ST: PL) se pueden utilizar para indicar la sensibilidad de la planta a la sal: los valores más altos mantienen la integridad estructural y disminuyen la permeabilidad de la membrana9. La inversa de esta relación (PL: ST) se ha estudiado en tejidos bivalvos durante la adaptación a la temperatura10.
Las clases de lípidos marinos se pueden separar mediante cromatografía de capa delgada (TLC) en varillas recubiertas de gel de sílice (Paso 4 del Protocolo) y luego detectarse y cuantificarse mediante detección de ionización de llama (FID) en un escáner FID automático. TLC/ FID se ha utilizado rutinariamente para muestras marinas, ya que proporciona rápidamente datos de clase de lípidos sinópticos de muestras pequeñas y, al tomar la suma de todas las clases, un valor para los lípidos totales. TLC/FID ha sido sometido a una evaluación de garantía de calidad (QA) y se encontró que cumple con los estándares requeridos para una calibración externa consistente, espacios en blanco bajos y análisis de réplica preciso11. Los coeficientes de variación (CV) o las desviaciones estándar relativas son de alrededor del 10%, y los datos lipídicos totales del escáner FID son normalmente alrededor del 90% de los obtenidos por métodos gravimétricos y otrosmétodos 2. La gravimetría proporciona lípidos totales más altos probablemente porque el escáner FID mide solo compuestos no volátiles, y también como resultado de la posible inclusión de material no lipídico en las mediciones gravimétricas.
La información proporcionada por el análisis de la clase de lípidos es especialmente útil cuando se combina con determinaciones de ácidos grasos como individuos, o esteroles, o los dos en combinación. El primer paso hacia estos análisis implica la liberación de todos los ácidos grasos componentes junto con los esteroles en los extractos de lípidos (Protocolo paso 5). La amplia variedad de estructuras y funciones lipídicas significa que han visto un amplio uso en estudios ecológicos y biogeoquímicos que evalúan la salud de los ecosistemas y la medida en que han sido influenciados por insumos antropogénicos y terrestres. Se han utilizado para medir la biosíntesis de sustancias de valor dietético para la fauna marina, así como para indicar la calidad de las muestras de agua. La medición de lípidos en muestras de núcleos de sedimentos ayuda a mostrar la sensibilidad de los sedimentos a los cambios en el uso humano de la tierra cerca del margen tierra-mar.
La herramienta principal para identificar y cuantificar compuestos lipídicos individuales ha sido tradicionalmente la cromatografía de gases (GC) con FID. Sin embargo, antes del análisis, estos compuestos se hacen más volátiles por derivatización. Los ácidos grasos se liberan en presencia de un catalizador ácido (H2SO4) de las clases de lípidos de acilo (Figura 1). En química orgánica, el grupo acilo (R-C = O) generalmente se deriva de un ácido carboxílico (R-COOH). Luego se vuelven a esterificar a ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME), lo que proporciona mejores separaciones en las columnas GC (Paso 5 del protocolo).
Protocol
Representative Results
Discussion
La velocidad con la que el sistema TLC-FID proporciona información de clase de lípidos sinópticos a partir de muestras pequeñas hace que TLC-FID sea una herramienta capaz para examinar muestras marinas antes de emprender procedimientos analíticos más complicados. Tales análisis generalmente requieren la liberación de compuestos componentes de extractos de lípidos y derivatización para aumentar la volatilidad en el caso de la cromatografía de gases. Se ha encontrado que TLC-FID combinado con GC-FID es una poder…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) número 105379 a C.C. Parrish. La Red de Equipos de Investigación e Instrumentos Básicos de La Universidad Memorial (CREAIT) ayudó a financiar esta publicación.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
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