Determinazione delle classi lipidiche e lipidiche totali in campioni marini

Summary

Questo protocollo è per la determinazione dei lipidi in acqua di mare e campioni biologici. I lipidi nei filtrati vengono estratti con cloroformio o miscele di cloroformio e metanolo nel caso di solidi. Le classi lipidiche sono misurate mediante cromatografia a strato sottile con rilevamento della ionizzazione a fiamma e la loro somma fornisce il contenuto lipidico totale.

Abstract

I lipidi sono in gran parte composti da carbonio e idrogeno e, quindi, forniscono una maggiore energia specifica rispetto ad altre macromolecole organiche nel mare. Essendo ricchi di carbonio e idrogeno sono anche idrofobici e possono agire come solvente e vettore di assorbimento per contaminanti organici e quindi possono essere driver di bioaccumulo inquinante negli ecosistemi marini. La loro natura idrofobica facilita il loro isolamento dall’acqua di mare o da campioni biologici: l’analisi lipidica marina inizia con il campionamento e poi l’estrazione in solventi organici non polari, fornendo un metodo conveniente per la loro separazione da altre sostanze in una matrice acquatica.

Se l’acqua di mare è stata campionata, il primo passo di solito comporta la separazione in fazioni “disciolte” e “particolato” definite operativamente mediante filtrazione. I campioni vengono raccolti e i lipidi isolati dalla matrice del campione tipicamente con cloroformio per materia veramente disciolta e colloidi, e con miscele di cloroformio e metanolo per solidi e campioni biologici. Tali estratti possono contenere diverse classi da fonti biogeniche e antropogeniche. In questo momento, i lipidi totali e le classi lipidiche possono essere determinati. Il lipide totale può essere misurato sommando le classi lipidiche determinate individualmente che di solito sono state separate cromatograficamente. La cromatografia a strato sottile (TLC) con rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) viene regolarmente utilizzata per l’analisi quantitativa dei lipidi da campioni marini. TLC-FID fornisce informazioni sulla classe lipidica sinottica e, sommando le classi, una misurazione lipidica totale.

Le informazioni sulla classe lipidica sono particolarmente utili se combinate con misurazioni di singoli componenti, ad esempio acidi grassi e / o steroli, dopo il loro rilascio da estratti lipidici. L’ampia varietà di strutture e funzioni lipidiche significa che sono ampiamente utilizzate nella ricerca ecologica e biogeochimica che valuta la salute dell’ecosistema e il grado di influenza degli impatti antropogenici. Sono stati impiegati per misurare sostanze di valore dietetico per la fauna marina (ad esempio, acquafeed e / o prede) e come indicatore della qualità dell’acqua (ad esempio, idrocarburi).

Introduction

I metodi qui descritti riguardano sostanze che sono definite operativamente come lipidi marini. Questa definizione si basa sulla loro suscettibilità all’estrazione liquido-liquido in solventi organici non polari e fornisce un metodo conveniente per la loro separazione da altre sostanze in una matrice acquatica. La loro natura idrofoba facilita il loro isolamento dall’acqua di mare o dai campioni biologici, così come il loro arricchimento e la rimozione di sali e proteine.

La misurazione del contenuto lipidico e della sua composizione negli organismi marini è stata di grande interesse per l’ecologia della rete alimentare, la nutrizione dell’acquacoltura e la scienza dell’alimentazione per decenni. I lipidi sono componenti universali negli organismi viventi, che agiscono come molecole essenziali nelle membrane cellulari, come principali fonti di energia biodisponibile, fornendo isolamento termico e galleggiabilità e fungendo da molecole di segnalazione. Sebbene le procedure per la determinazione dei lipidi in altri campi siano state descritte bene, il loro uso con campioni marini richiede comunemente modifiche per adattarsi alle condizioni del campo e al tipo di campione¹.

Per i campioni di acqua di mare, la prima fase di solito richiede la separazione nelle frazioni “disciolte” e “particolato” definite operativamente, normalmente mediante filtrazione (fase 1 del protocollo). La frazione di particolato è ciò che viene trattenuto dal filtro e la dimensione dei pori è importante nella definizione del cut-off². Spesso, quando campioniamo il particolato, vorremmo mettere in relazione le concentrazioni lipidiche con le concentrazioni di massa totale, nel qual caso un campione separato, più piccolo, (ad esempio, 10 ml) deve essere preso per questo scopo (protocollo passo 1, nota). Per ottenere una determinazione accurata della massa è importante aggiungere il formate di ammonio (35 g/L) alla fine della filtrazione.

Il filtrato di acqua di mare dal campione più grande deve ammontare tra 250 ml e 1 L a seconda del tipo di campione ed è sottoposto all’estrazione liquido-liquido in un imbuto separatore (fase 2 del protocollo). La natura idrofobica dei lipidi significa che possono essere separati da altri composti mediante estrazione in un solvente non polare come il cloroformio. Viene creato un sistema a due strati in cui i lipidi si dividono nello strato organico mentre i componenti solubili in acqua rimangono nello strato acquoso.

Campioni di particolato su un filtro, o campioni biologici vengono estratti con un’estrazione modificata di Folch et al.³, che coinvolge anche il cloroformio (fase del protocollo 3). Ancora una volta, viene creato un sistema organico / acquoso in cui i lipidi si dividono nella fase organica, mentre le molecole solubili in acqua rimangono nella fase acquosa e le proteine vengono precipitate. Infatti, per i solidi, la maggior parte dei laboratori utilizza alcune variazioni della procedura di estrazione Folch et al.³ che coinvolge cloroformio e metanolo. Per i filtri, il primo passo è omogeneizzare in 2 ml di cloroformio e 1 ml di metanolo.

Durante l’estrazione, è necessario prestare attenzione per proteggere i lipidi da modifiche chimiche o enzimatiche, mantenendo campioni e solventi sul ghiaccio per ridurre l’idrolisi del legame estere o l’ossidazione a doppio legame carbonio-carbonio. I tessuti e i lipidi cellulari sono abbastanza ben protetti dagli antiossidanti naturali e dalla compartimentazione⁴; tuttavia, a seguito dell’omogeneizzazione dei campioni, il contenuto cellulare viene combinato rendendo i lipidi più disposti all’alterazione, chimicamente o enzimaticamente. Alcuni lipidi, come la maggior parte degli steroli, sono molto stabili, mentre altri, come quelli contenenti acidi grassi polinsaturi, sono più suscettibili all’ossidazione chimica. Altri, come gli steroli con doppi legami coniugati, sono inclini all’ossidazione catalizzato dalla luce⁵. Dopo le estrazioni, i lipidi sono molto più suscettibili all’ossidazione chimica e i campioni devono essere conservati sotto un gas inerte come l’azoto. Un flusso delicato di azoto verrebbe anche usato per concentrare gli estratti.

Dopo la concentrazione, i lipidi sarebbero normalmente quantificati alla rinfusa in quanto sono una componente importante degli ecosistemi marini che forniscono un’alta concentrazione di energia, più del doppio del kJ / g di carboidrati e proteine. Invariabilmente verrebbero poi quantificati come singoli componenti: l’analisi completa dei lipidi comporta generalmente la separazione in categorie più semplici, in base alla loro natura chimica. Pertanto, un’analisi completa comporta la misurazione dei lipidi totali, delle classi lipidiche e dei singoli composti.

Il lipide totale può essere determinato prendendo la somma delle classi lipidiche misurate individualmente separate dalla cromatografia⁶. Un estratto lipidico marino può contenere più di una dozzina di classi da fonti biogeniche e antropogeniche. L’ampia varietà di strutture lipidiche significa che molte informazioni possono essere ottenute determinando singoli raggruppamenti di strutture. Le classi lipidiche individualmente, o in alcuni gruppi, sono state utilizzate per segnalare la presenza di alcuni tipi di organismi, nonché il loro stato fisiologico e l’attività². Sono stati anche utilizzati come indicatore delle origini del materiale organico, compresa la materia organica disciolta (DOM) e i contaminanti idrofobici.

Triacilgliceroli, fosfolipidi e steroli sono tra le più importanti classi lipidiche biogeniche. I primi due sono biochimicamente correlati in quanto possiedono una spina dorsale di glicerolo a cui sono esterificati due o tre acidi grassi (Figura 1). I triacilgliceroli, insieme agli esteri di cera, sono sostanze di stoccaggio molto importanti, mentre altre classi lipidiche contenenti acidi grassi come diacilgliceroli, acidi grassi liberi e monoacilgliceroli sono generalmente costituenti minori. Gli acidi grassi liberi sono presenti a concentrazioni più basse negli organismi viventi, in quanto quelli insaturi possono essere tossici⁷. Anche gli steroli (sia nelle loro forme libere che esterificate) e gli alcoli grassi sono inclusi tra i lipidi meno polari, mentre i glicolipidi e i fosfolipidi sono lipidi polari. I lipidi polari hanno un gruppo idrofilo, che consente la formazione di doppi strati lipidici presenti nelle membrane cellulari. Gli steroli liberi sono anche componenti strutturali della membrana e, se assunti in rapporto ai triacilgliceroli, forniscono una condizione o un indice nutrizionale (TAG: ST) che è stato ampiamente utilizzato⁸. Se presi in rapporto ai fosfolipidi (ST: PL) possono essere utilizzati per indicare la sensibilità delle piante al sale: valori più alti mantengono l’integrità strutturale e diminuiscono la permeabilità della membrana⁹. L’inverso di questo rapporto (PL: ST) è stato studiato nei tessuti bivalvi durante l’adattamento della temperatura¹⁰.

Le classi lipidiche marine possono essere separate mediante cromatografia a strato sottile (TLC) su barre rivestite in gel di silice (fase 4 del protocollo) e quindi rilevate e quantificate mediante rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) in uno scanner FID automatico. TLC / FID è diventato abitualmente utilizzato per i campioni marini in quanto fornisce rapidamente dati di classe lipidica sinottica da piccoli campioni e, prendendo la somma di tutte le classi, un valore per i lipidi totali. TLC/FID è stato sottoposto a una valutazione di garanzia della qualità (QA) ed è risultato che soddisfa gli standard richiesti per una calibrazione esterna coerente, spazi vuoti bassi e analisi di replica precisa¹¹. I coefficienti di variazione (CV) o le deviazioni standard relative sono intorno al 10% e i dati lipidici totali dello scanner FID sono normalmente circa il 90% di quelli ottenuti con metodi gravimetrici e altri metodi². La gravimetria dà lipidi totali più elevati probabilmente perché lo scanner FID misura solo composti non volatili e anche come risultato della possibile inclusione di materiale non lipidico nelle misurazioni gravimetriche.

Le informazioni fornite dall’analisi della classe lipidica sono particolarmente utili se combinate con le determinazioni degli acidi grassi come individui, o steroli, o i due in combinazione. Il primo passo verso queste analisi prevede il rilascio di tutti gli acidi grassi componenti insieme agli steroli negli estratti lipidici (fase 5 del protocollo). L’ampia varietà di strutture e funzioni lipidiche significa che hanno visto un ampio uso in studi ecologici e biogeochimici che valutano la salute dell’ecosistema e la misura in cui sono stati influenzati da input antropogenici e terrestri. Sono stati utilizzati per misurare la biosintesi di sostanze di valore dietetico per la fauna marina e per indicare la qualità dei campioni di acqua. La misurazione dei lipidi nei campioni di carote di sedimenti aiuta a mostrare la sensibilità dei sedimenti ai cambiamenti nell’uso del suolo umano vicino al margine terra-mare.

Lo strumento principale per identificare e quantificare i singoli composti lipidici è stato tradizionalmente la gascromatografia (GC) con FID. Prima dell’analisi, tuttavia, questi composti sono resi più volatili dalla derivatizzazione. Gli acidi grassi vengono rilasciati in presenza di un catalizzatore acido (H₂SO₄) dalle classi lipidiche acilice (Figura 1). In chimica organica, il gruppo acilico (R-C = O) è solitamente derivato da un acido carbossilico (R-COOH). Vengono quindi riesterificati in esteri metilici degli acidi grassi (FAME) che danno migliori separazioni sulle colonne GC (fase del protocollo 5).

Protocol

NOTA: Per pulire bicchieri, strumenti e filtri per analisi lipidiche, lavarli 3 volte con metanolo seguito da 3 lavaggi con cloroformio o riscaldarli a 450°C per almeno 8 ore. 1. Procedura di filtrazione per i lipidi disciolti e particolati dell’acqua di mare NOTA: La particolare frazione di interesse è definita operativamente dalla procedura di filtrazione. In questo caso la dimensione dei pori è di 1,2 μm. Impostare il collettore di …

Representative Results

Essendo il settore della produzione alimentare in più rapida crescita, l’acquacoltura si sta evolvendo in termini di innovazioni tecnologiche e adattamenti per soddisfare le mutevoli esigenze. Uno di questi è ridurre la dipendenza dalla farina di pesce e dall’olio di pesce di origine selvatica, che forniscono ingredienti per mangimi per molte specie di acquacoltura. Gli oli vegetali terrestri sono stati studiati come sostituti sostenibili ed economici dell’olio di pesce negli aquafeed e il fegato è un tessuto bersagli…

Discussion

La velocità con cui il sistema TLC-FID fornisce informazioni sulla classe lipidica sinottica da piccoli campioni rende TLC-FID uno strumento in grado di selezionare campioni marini prima di intraprendere procedure analitiche più coinvolte. Tali analisi di solito richiedono il rilascio di composti componenti da estratti lipidici e la derivatizzazione per aumentare la volatilità nel caso della gascromatografia. TLC-FID combinato con GC-FID è stato trovato per essere una potente combinazione per estratti di frutti di ma…

Materials

15 ml vials	VWR	66009-560
1-hexadecanol	Sigma	258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol	Sigma	M1640-1g
2 ml vials	VWR	46610-722
25 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32A
2ml pipet bulbs	VWR	82024-554
47 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32
5 3/4" pipets	Fisher	1367820A
9" pipets	Fisher	1367820C
Acetone	VWR	CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890	Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm	VWR	CACX0160-1
Caps for 2 ml vials	VWR	46610-712
chloroform	VWR	CACX1054-1
Cholesteryl palmitate	Sigma	C6072-1G
Chromarod S5	Shell USA	3252
Dichloromethane	VWR	CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl	Sigma	P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L	VWR	CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate	Sigma	T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl	Sigma	58381
Helium	Air Liquide	A0492781
Hexane	VWR	CAHX0296-1
Hydrogen regulator	VWR	55850-484
Iatroscan MK6	Shell USA
Kimwipes	Fisher	066662
Medical Air	Air Liquide	A0464563
Medium nitrile gloves	Fisher	191301597C
Nitrile gloves L	VWR	CA82013-782
Nitrogen	Air Liquide	A0464775
Nitrogen Regulator	VWR	55850-474
Nonadecane	Sigma	74158-1G
Palmitic acid	Sigma	P0500-10G
Repeating dispenser	Sigma	20943
Sodium Bicarbonate 1kg	VWR	CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr	VWR	CA71008-804
Sulfuric acid	VWR	CASX1244-5
Teflon tape	Fisher	14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator	OMNI International	TM125-115
TLC development tank	Shell USA	3201
UHP hydrogen	Air Liquide	A0492788
VWR solvent repippetter	VWR	82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel	VWR	89140-196
Zebron ZB-Wax GC column	Phenomenex	7HM-G013-11